肺腺癌A549細胞KDR基因沉默后對厄羅替尼敏感性的影響

肺腺癌A549細胞KDR基因沉默后對厄羅替尼敏感性的影響

張秀義勾建強

(承德市中心醫院呼吸內科，河北承德067000)

摘要〔〕目的研究激酶功能區受體(KDR)基因沉默對人肺腺癌A549細胞增殖和對化療藥物厄羅替尼敏感性的影響。方法設計合成KDR的siRNA序列，LipofectamineTM2000 轉染人A549細胞。RT-PCR和Western印跡檢測KDR在干擾后mRNA和蛋白的表達情況，通過流式細胞儀檢測細胞周期。MTT法和細胞克隆形成試驗觀察KDR基因沉默后A549細胞對厄羅替尼的敏感性。結果KDR基因沉默48 h后，A549細胞的KDR基因和蛋白表達明顯降低(P<0.05)。細胞周期被阻滯在G0/G1期，S期細胞數明顯減少(P<0.05)。KDR基因沉默組細胞對厄羅替尼的敏感性顯著性增強。結論KDR特異性siRNA能顯著沉默A549細胞KDR基因，抑制細胞增殖，并增強A549細胞對厄羅替尼的敏感性。

關鍵詞〔〕激酶功能區受體(KDR)； siRNA； 肺腺癌；A549細胞；厄羅替尼

中圖分類號〔〕R734.2〔文獻標識碼〕A〔

第一作者：張秀義(1977-)，女，主治醫師，主要從事呼吸系統疾病研究。

肺腺癌是肺癌一種組織學類型，發病率逐年上升,發病年齡也逐漸年輕化，早期可出現淋巴或血行轉移，對放化療不敏感，嚴重制約肺腺癌5年生存率〔1，2〕。腫瘤的增殖與基因調控有關，為臨床醫生提供了新的有效治療腫瘤途徑〔3〕。研究表明肺腺癌細胞的發病、侵襲、轉移涉及許多基因的激活、失活〔4〕。研究發現〔5〕激酶功能區受體(KDR)基因在肺腺癌細胞增殖中發揮重要作用，可作為腫瘤治療的新靶點。在肺腺癌綜合治療過程中化療占有重要的位置，厄羅替尼是肺腺癌最常用、最有效的化療藥物之一〔6〕。本研究探討KDR基因沉默對人肺腺癌A549細胞增殖的影響，并與厄羅替尼聯用后增強人肺腺癌A549細胞對厄羅替尼的敏感性。

1材料與方法

1.1主要材料肺腺癌細胞株A549購于中國科學院上海細胞究所。RPMI1640培養液、胰蛋白酶和胎牛血清均購自美國Gibco公司。LipofectamineTM2000脂質體轉染試劑和TRIzol購自美國Invitrogen公司；RT-PCR兩步法試劑盒(北京賽百盛基因技術有限公司)， cDNA合成試劑盒(日本TOYOBO公司)；AMV逆轉錄試劑盒(杭州博日)；厄羅替尼(Erlotinib，商品名特羅凱)由羅氏公司惠贈；siRNA基因片段由上海吉瑪化學公司合成；G418購自美國Klontech公司；KDR鼠抗人單克隆抗體購自美國Santa Cruz公司；5%四甲基偶氮唑藍、HRP標記的羊抗鼠二抗購自北京中杉公司；厄羅替尼(AstraZeneca UK Limited)；流式細胞儀(COULTER XL;Coulter)；550酶標儀(美國Biorad公司)，生物倒置顯微鏡(Olympus CKX4)。電化學發光(ECL)試劑盒購自美國Thermo公司；放射免疫測定(RIPA)蛋白裂解液購自江蘇碧云天公司。

1.2siRNA設計、合成及轉染依據文獻〔7〕KDR siRNA和陰性對照組 siRNASCR(scramble siRNA)序列分別為：5'-GCCACCAUGUUCUCUAAUA'I’I'-3’(正義鏈)5'-UAUUAGAGAACAUGGUGGCAT-3’(反義鏈)；5'-UUCUCCGAACGUGUCACGU'IT-3’(正義鏈)，5'-ACGUGACACGUUCGGAGAATI’-3’(反義鏈)。均由上海吉瑪化學公司合成，MGC-803細胞培養于含體積分數10%小牛血清的RPMI1640完全培養液(37℃恒溫、5%CO2、飽和濕度)中培養。每3~4 d傳代1次，取對數生長期細胞用于實驗。按1×105個/孔將胃癌MGC-803接種于24孔板中，當融合率達70%時以脂質體法進行轉染，轉染時分為3組：轉染pGenesil-1-KDR-siRNA載體者為A549/KDR-siRNA組(實驗組)，轉染隨機對照載體者為A549/control組(對照組)，未轉染的肺腺癌細胞株A549細胞為A549組(空白組)。于轉染后48 h行RNA干擾效應的檢測。

1.3RT-PCR檢測棄培養液后PBS沖洗細胞3次，用TRIzol法提取總RNA，通過cDNA合成試劑盒反轉錄合成cDNA。分別擴增KDR和內參GAPDH。KDR上游引物：5’-CTGGCATGGTCTFCTGTGAAGCA-3’，下游引物：5’-AATACCAGTGGATGTGATGCGG-3’，擴增產物795 bp；內參照GAPDH上游引物：5’-CGTGGAAGGACTCATGACCA-3’，下游引物：5’TCCAGGGGTCTTACTCCTTG-3’，擴增產物為509 bp。PCR反應條件為94℃變性2 min，按94℃變性45 s、62℃退火1 min、72℃延伸1 min進行反應，循環35次，再于72℃延伸8 min。2%瓊脂糖水平板電泳，100 V電壓電泳45 min。用凝膠自動成像及分析系統(法國VI)進行吸光度掃描,用KDR吸光度/GAPDH吸光度值作為mRNA表達的相對強度。

1.4Westem印跡檢測細胞棄培養液后PBS沖洗3次，加入預冷的RIPA裂解液150 μl，RIPA裂解液預先加PMSF 1.5 μl使其終濃度為1 mmol/L。操作在冰上進行， 4℃下，10 000 r/min離心5 min后取上清液，通過BCA法測蛋白濃度后，99 ℃ 變性10 min。取50 μg蛋白行10%SDS-PAGE電泳，通過電轉移印跡到PVDF膜上，封閉液中孵育1 h加入1∶1 000稀釋的KDR一抗，4℃過夜。TBST洗膜5 min,共3次，加入1∶5 000 HRP標記的二抗和GAPDH,于37℃孵育2 h PBS洗滌，采用ECL法檢測。

1.5流式細胞儀檢測細胞周期 收集3組細胞，調整細胞濃度為1×106/L，冷PBS 洗滌2 次,加入70 %的冷乙醇(4℃) 固定24 h后，洗滌細胞，與含10 μg/ml RNA 酶的Tris-HCl緩沖液(pH7.4) 共同孵育30 min。50 μg/ml 碘化丙啶(PI)進行細胞的DNA 染色，1 h 內通過流式細胞儀分析細胞的DNA含量分布，并計算出各個周期細胞所占的百分率。

1.6MTT檢測干擾KDR后A549對厄羅替尼的敏感性 細胞轉染干擾質粒48 h后，收集轉染和未轉染的A549細胞， 接種于96孔板， 每個樣本做3個復孔， 當細胞貼壁后，加入不 同濃度的厄羅替尼(10、25、50、100、200 μmol/L)培養48 h ；每孔加MTT 20 μl(濃度為5 mg/ml)，放置孵箱內4 h后棄上清加入10%的十二烷基磺酸鈉(SDS)200 μl，過夜。震蕩15 min，用全自動酶標儀檢測490 nm處的吸光度值(A值)。抑制率(%)=(A對照-A實驗)/(A對照-A空白)×100%。

1.7平板克隆檢測干擾KDR后A549對厄羅替尼的敏感性細胞轉染干擾質粒48 h后，收集轉染和未轉染的A549細胞， 接種于6孔板 ， 每個樣本做3個復孔， 細胞貼壁后，加入不 同濃度的厄羅替尼(10、25、50、100、200 μmol/L)培養中培養7 d，去除培養液，PBS洗2次，95%乙醇固定10 min，吉姆薩染液染色10 min，自來水沖洗后，晾干，通過Quantity One軟件計算克隆數。克隆形成抑制率(%)=1-(實驗組克隆數/對照組克隆數)×100%。

1.8統計學方法采用SPSS14.0統計軟件進行t檢驗、方差分析。

2結果

2.1siRNA抑制KDR mRNA的表達實驗組條帶明顯變窄，實驗組KDR mRNA表達(0.28±0.06)與對照組(0.56±0.07)和空白組(0.57±0.08)差異均有統計學意義(P<0.05)。見圖1。

2.2siRNA抑制KDR蛋白的表達實驗組條帶明顯變窄， 實驗組KDR蛋白灰度值(0.32±0.06)與對照組(0.71±0.08)和空白組(0.70±0.09)差異顯著(P<0.05)。見圖1。

圖1　A549細胞中KDR mRNA和蛋白的表達

2.3流式細胞儀檢測細胞周期G0/G1期實驗組較對照組和空白組明顯增加，S期明顯減少(P<0.05)，3組M期細胞無明顯變化(P>0.05)。說明實驗組有明顯的S期阻滯。見表1，圖2。

圖2　流式細胞儀分析A549細胞的細胞周期

組別G0/G1期S期G2/M期空白組58.3±3.733.7±3.37.8±1.7對照組58.2±3.933.8±4.28.6±1.4實驗組70.3±5.61)20.9±3.61)9.3±2.1

和空白組、對照組比較：1)P<0.05；下表同

2.4干擾KDR后A549對厄羅替尼的敏感性提高轉染pgsiRNA-KDR后，A549細胞對不同濃度的厄羅替尼敏感性均提高。隨著藥物濃度的增加，厄羅替尼對細胞的抑制率也增加，呈現出劑量依賴性，實驗組細胞對不同濃度的厄羅替尼敏感性顯著高于對照組和空白組(P<0.05)。見表2。

厄羅替尼濃度(μmol/L)空白組對照組實驗組1016.34±1.5716.23±1.4526.45±1.351)2522.67±1.3423.23±1.6337.24±1.351)5030.85±2.2331.52±1.3650.45±3.021)10040.45±3.2341.65±2.2878.52±2.361)20050.45±3.8050.42±3.2491.42±4.681)

2.5對A549細胞集落形成的影響轉染 pgsiRNA-KDR后，A549細胞對不同濃度的厄羅替尼敏感性均提高，細胞克隆形成數明顯減少，克隆形成抑制率明顯增高(P<0.05)。隨著藥物濃度的增加，厄羅替尼對細胞的克隆形成抑制率也增加，呈現出劑量依賴性，實驗組細胞對不同濃度的厄羅替尼克隆形成抑制率顯著高于對照組和空白組(均P<0.05)。見表3。

厄羅替尼濃度(μmol/L)空白組對照組實驗組1026.12±1.2326.57±1.6334.45±1.631)2536.42±1.3236.85±1.2546.72±1.611)5046.52±2.3246.42±2.5257.73±2.641)10056.42±2.0156.35±2.6567.52±2.341)20067.32±2.5468.42±2.5279.64±2.531)

3討論

肺腺癌作為一種全身性疾病，早期可出現淋巴或血行轉移，發病率呈逐年上升、發病年齡呈逐漸年輕化的趨勢〔1〕。目前國內外臨床醫生對肺腺癌患者主要采去手術治療、化療、放療、內分泌治療、生物分子靶向治療等綜合治療方案，但其復發、轉移仍然是目前臨床醫生面臨的巨大難題。隨著人類基因組計劃的完成及功能基因學的不斷發展，目前腫瘤基因治療成為科研上研究熱點，并且在腫瘤綜合治療上基因治療得到了醫學界廣泛的重視〔7〕。肺腺癌細胞增殖與眾多基因結構、功能異常有關，明確肺腺癌發病中的關鍵基因對臨床上預防、診斷及治療肺腺癌具有重大意義〔8〕。

近些年來隨著RNA干擾技術的不斷發展，其已經成為腫瘤基因治療中的研究熱點，由dsRNA分子介導的轉錄后沉默基因，具有高效、特異的抑制與腫瘤發病及耐藥有關的多種基因表達的特點，廣泛用于腫瘤、基因等疾病研究，開辟了有效治療腫瘤新路徑〔9〕。KDR廣泛分布在血管內皮細胞，在血管內皮細胞的生長分化中起重要作用，具有增加血管通透性、促進新生血管生成和血管內皮細胞增殖的作用，成為近年來熱點研究對象〔5，10〕。通常情況下血管內皮細胞更新緩慢，但在腫瘤組織中的血管內皮細胞增殖活躍，KDR高表達，介導血管內皮生長因子在腫瘤新生血管中形成〔11，12〕。在肺腺癌的綜合治療中化療占有重要的地位，化療在肺腺癌的綜合治療中占有重要位置，肺腺癌最常用、最有效的化療藥物是厄羅替尼〔6，13〕。本研究提示，KDR基因沉默導入肺腺癌A549細胞內,特異性干擾KDR 基因表達能夠有效抑制人肺腺癌細胞增殖并對厄羅替尼的化療敏感性顯著性增強，KDR的siRNA序列為治療人肺腺癌提供了新的理論依據〔14〕。KDR基因沉默及厄羅替尼兩者結合，能在一定程度上有效誘發人肺腺癌A549細胞的自發凋亡及提高其對化療藥物厄羅替尼的敏感性。

綜上，KDR siRNA可以顯著沉默A549細胞KDR基因和蛋白的表達，抑制人肺腺癌A549細胞增殖，顯著影響人肺腺癌A549細胞的生長速度，與厄羅替尼聯用，具有明顯的協同效應，增強人肺腺癌A549細胞對厄羅替尼的化療敏感性。

4參考文獻

1Tsuta K,Kawago M,Yoshida A,etal.Primary lung adenocarcinoma with morule-like components:a unique histologic hallmark of aggressive behavior and EGFR mutation〔J〕.Lung Cancer,2014;85(1):12-8.

2Lortet-Tieulent J,Soerjomataram I,Ferlay J,etal.International trends in lung cancer incidence by histological subtype:adenocarcinoma stabilizing in men but still increasing in women〔J〕.Lung Cancer,2014;84(1):13-22.

3Santos SC,Miguel C,Domingues I,etal.IVEGF and VEGFR-2(KDR) internalization is required for endothelial recovery during wound healing〔J〕.Experim Cell Res,2007;313(8)：1561-74.

4Iannolo G,Sciuto MR,La Rosa C,etal.MARCH-I expression in cord blood CD34+KDR+cells〔J〕.Clin Biochem,2011;44(8-9):725-7.

5Cantoni S,Cavallini C,Bianchi F,etal.Vasculogenic response of human placental stem cells through PI3K/AKT pathway〔J〕.Pharmacol Res,2012;65(3):275-84.

6Renouf DJ,Tang PA,Hedley D,etal.A phase Ⅱ study of erlotinib in gemcitabine refractory advanced pancreatic cancer〔J〕.Eur J Cancer,2014;50(11):1909-15.

7Frank D,Rinkevich,Cathy Su,etal.Multiple evolutionary origins of knockdown resistance(kdr) in pyrethroid-resistant Colorado potato beetle,leptinotarsa decemlineata〔J〕.Pestic Biochem Physiol,2012;104(3):192-200.

8Gatecki P,Orzechowska A,Berent D,etal.Vascular endothelial growth factor receptor 2 gene(KDR) polymorphisms and expression levels in depressive disorder〔J〕.J Affect Disord,2013;147,(1-3):144-9.

9Curtin ML,Heyman HR,Frey RR,etal.Pyrazole diaminopyrimidines as dual inhibitors of KDR and Aurora B kinases〔J〕.Bioorgan Med Chem Lett,2012;22(14):4750-5.

10Adham SA,Coomber BL.Glucose is a key regulator of VEGFR2/KDR in human epithelial ovarian carcinoma cells〔J〕.Communications,2009;390(1):130-5.

11Holmes DI,Zachary IC.Vascular endothelial growth factor regulates stanniocalcin-1 expression via neuropilin-1-dependent regulation of KDR and synergism with fibroblast growth factor-2〔J〕.Cell Signal,2008;20(3):569-79.

12Kim CW,Son KN,Choi SY,etal.Human lactoferrin upregulates expression of KDR/Flk-1 and stimulates VEGF-A-mediated endothelial cell proliferation and migration〔J〕.FEBS Lett,2006;580(18):4332-6.

13Vickers MM,Powell ED,Asmis TR,etal.Comorbidity,age and overall survival in patients with advanced pancreatic cancer-Results from NCIC CTG PA.3:a phase III trial of gemcitabine plus erlotinib or placebo〔J〕.Eur J Cancer,2012;48(10):1434-42.

14Foster KA,Regan HK,Danziger AP,etal.Delayed administration of a novel small molecule KDR kinase inhibitor〔J〕.Neurosci Res,2009;63(1):10-6.

〔2013-12-17修回〕

(編輯苑云杰)

·心腦血管、代謝性疾病·