μ型阿片受體參與CFA大鼠慢性炎性痛的外周調控

研究報告

μ型阿片受體參與CFA大鼠慢性炎性痛的外周調控

何曉芬，蔣永亮，尹小虎，沈亞芳，方劍喬

(浙江中醫藥大學第三臨床醫學院，杭州310053)

【摘要】目的觀察大鼠慢性炎性痛時背根神經節(dorsal root ganglion，DRG)μ型阿片受體(mu opioid receptor，MOR)表達的變化及炎癥局部注射MOR激動劑和拮抗劑對痛閾的干預作用，探討MOR在慢性炎性疼痛中的作用。 方法 足底注射弗氏完全佐劑(complete freund’s adjuvant，CFA)制備大鼠慢性炎性痛模型，采用免疫組化法檢測DRG MOR陽性細胞的表達；經大鼠足跖背部分別注射MOR激動劑、拮抗劑，采用輻射熱法檢測給藥前后大鼠痛閾的變化。 結果 足底注射CFA誘導出大鼠慢性炎性痛，在造模后第18天，痛閾依然低于正常對照組；免疫組化結果表明，與正常對照組相比，CFA大鼠DRG MOR陽性細胞表達增多(P < 0.01)；足跖背部注射MOR激動劑減輕CFA大鼠的疼痛，對正常大鼠痛閾無影響；足跖背部注射MOR拮抗劑加重CFA大鼠的疼痛，對正常大鼠痛閾無影響。 結論DRG神經元MOR在慢性炎性痛時表達上調，參與慢性炎性痛的外周調控，可能有助于防止慢性痛的進一步加重。

【關鍵詞】外周；μ型阿片受體；慢性痛；炎癥；

[基金項目]國家自然科學基金資助項目(81072855，81303039)；浙江省自然科學基金資助項目(LY12H27015，Z2100979)；國家中醫藥管理局重點學科(針灸學)建設經費資助(國中醫藥發[2009]30號)。

[作者簡介]何曉芬(1986-)，女，助理研究員。研究方向；針刺鎮痛與免疫調節的相關性研究。E-mail: zjhxf1986@163.com。

[通訊作者]方劍喬(1961-)，男，教授，博士生導師。研究方向：針刺鎮痛與免疫調節的相關性研究。E-mail: fangjianqiao7532@163.com。

【中圖分類號】R332【文獻標識碼】 A

doi:10.3969.j.issn.1671.7856. 2015.001.005

The involvement of mu opioid receptorin peripheral regulation of

chronic inflammatory pain induced by CFAin rats

HE Xiao-fen，JIANG Yong-liang，YIN Xiao-hu，SHEN Ya-fang，FANG Jian-qiao

(The Third Clinical Medical College, Zhejiang Chinese Medical University, Hangzhou 310053, China)

Abstract【】ObjectiveTo investigate the change of mu opioid receptor (MOR) in dorsal root ganglion (DRG) in rat chronic inflammatory pain model and the effect of MOR agonist and antagonis tintraplantarly (i.pl.) injected on pain threshold, so as to determine the role of peripheral MOR in chron in inflammatory pain. Methods Chronicin flammatory pain model was established by i.pl. injection of CFA in rats. The expression of MOR in DRG was detected by immunohistochemistry. Pain threshold before and after i.pl. injection of MOR agonist and antagonist was measured by radiant heat method. ResultsRats suffered from an intraplantar injection of CFA developed chronic inflammatory pain,and the painthreshold still reduced on 18 day after CFA injection compared to that in the normal group. Immunohistochemistry staining revealed that compared with the normal group, the expression of MOR in DRG of CFA rats was increased (P<0.01). After the paw dorsal surface injection of MOR agonist, the pain threshold of CFA rats was increased, while that of normal rats exhibited no significant change. After the paw dorsal surface injection of MOR antagonist, the pain threshold of CFA rats was reduced, while that of normal rats had no significant change. Conclusion Under chronic inflammatory pain condition, DRG MOR expressionis enhanced, which participates in the regulation of chronic inflammatory pain, and may contribute to the prevention of further more serious pain.

【Key words】Periphery；Mu opioid receptor；Chronic pain；Inflammation

疼痛的慢性化是當前疼痛治療的難點。傳統的阿片類藥物作為臨床上最常用的鎮痛藥物之一[1-2]，主要通過激活中樞阿片受體發揮鎮痛作用，但是除鎮痛作用外，基于中樞神經系統的鎮痛藥物具有成癮性、耐藥性和呼吸抑制等中樞副作用[3-4]，因此，尋找能有效控制疼痛、減少毒副作用的新型鎮痛藥物已成為研究的熱點。研究表明，阿片受體在背根神經節(dorsal root ganglion，DRG)合成，轉運至中樞和外周神經末梢[5]。阿片受體是介導疼痛調節的重要受體之一，通過結合配體阿片肽發揮鎮痛作用。在弗氏完全佐劑(complete freund’s adjuvant，CFA)誘導的急性炎性痛模型中，在造模后2 h和96 h，DRG μ阿片受體(mu opioid receptor, MOR)的mRNA表達水平明顯增加[6]。研究表明阿片受體參與早期炎性痛的調節[7-8]。但目前尚不清楚慢性炎性痛時DRG MOR表達的變化情況，及是否也參與慢性炎性痛的調制。

本實驗采用CFA制作大鼠慢性炎性痛模型，觀察慢性炎性痛時大鼠DRG MOR表達的變化，觀察炎癥局部注射MOR激動劑、拮抗劑對慢性炎性痛的干預作用，探討外周MOR受體是否參與慢性炎性痛的調節，為臨床上阿片類藥物的外周局部應用提供科學依據。

1材料和方法

1.1實驗動物

選用清潔級雄性Wistar大鼠，體重為190±10 g，購自中國科學院上海實驗動物中心【SCXK (滬) 2008-0016】，由浙江中醫藥大學實驗動物中心【SYXK (浙) 2013-0184】飼養。

1.2主要試劑和儀器

試劑：弗氏完全佐劑(complete freund’s adjuvant，CFA)由美國Sigma公司提供；MOR抗體由美國abcam公司提供；生物素標記山羊抗兔IgG和辣根酶標記鏈酶卵白素均由北京中杉金橋生物技術有限公司提供；MOR拮抗劑和MOR激動劑均由Tocris公司提供。

儀器：足底測量儀(意大利UGO BASILE公司)、DM2500顯微鏡(德國徠卡)、Thermo冰凍切片機(美國賽默飛世爾科技公司)等。

1.3方法

1.3.1慢性炎性痛模型的制備

除正常(normal)組大鼠外，其余各組大鼠在右后足足底內注射弗氏完全佐劑(CFA)0.1 mL/只，建立大鼠慢性炎性痛模型。正常組大鼠右后足足底內注射相同劑量生理鹽水。

1.3.2痛閾測定

采用足底測量儀檢測各組大鼠患側熱縮腿閾值(paw withdrawal latency, PWLs)作為痛閾指標。具體操作如下：測量前，將大鼠置于透明塑料盒30 min。待大鼠安靜后，將聚焦的紅外熱源置于大鼠右后足中央，避開足墊，啟動“START”按鈕對足底進行熱刺激，儀器自動記錄大鼠縮足反應時的潛伏期和紅外輻射強度。20 s是刺激時間最上限，30為最大熱輻射強度。連續測量3次，每次間隔5 min。

1.3.3樣本采集

大鼠用10%水合氯醛(0.35 mL/100 g)腹腔麻醉，開胸暴露心臟，經升主動脈用生理鹽水150 mL快速灌注，再緩慢灌注4 %多聚甲醛 150 mL，然后用500 mL 4 %多聚甲醛溶液先快后慢滴注，快速取出大鼠L5DRG，4 %多聚甲醛溶液中后固定2 h，15%、30%蔗糖溶液梯度脫水，液氮速凍，-80℃保存備用。

1.3.4免疫組化檢測CFA大鼠L5DRG的MOR陽性細胞表達

L5DRG行冰凍切片(14 μm)，將切片貼于涂有多聚賴氨酸的載玻片上，PBS洗10 min×3次；0.3% H2O237℃孵育30 min以消除內源性過氧化物酶；5%山羊血清37℃孵育30 min以封閉非特異性位點；加兔抗大鼠MOR抗體(1∶2500)，4℃孵育過夜；生物素化山羊抗兔IgG(1∶750)中，37℃孵育1 h；辣根酶標記鏈酶親合素(1∶400)中，37℃孵育1 h；切片上滴加新鮮配置的 DAB顯色液，染色30 s；雙蒸水清洗5 min，終止染色反應，自然風干；酒精脫水，二甲苯透明處理，中性樹膠封片。每次孵育之間，切片用 PBS清洗 10 min×3次。顯微鏡下觀察以細胞染成棕黃色，細胞輪廓清晰為陽性細胞。

1.3.5足跖局部注射MOR激動劑試驗

為進一步驗證DRG上調的MOR是否參與慢性炎性痛的調節以及為臨床局部應用阿片類藥物提供理論基礎，在正常大鼠和CFA慢性炎性痛大鼠足跖局部注射MOR激動劑。實驗分為模型+生理鹽水組、模型+MOR激動劑組、正常+MOR激動劑組，模型+MOR激動劑組和正常+MOR激動劑組大鼠在造模后D18在大鼠足跖局部注射4 μg MOR激動劑，模型+生理鹽水組大鼠足底內注射相同劑量0.05 mL生理鹽水。檢測注射生理鹽水或MOR激動劑之前及注射后30 min的痛閾。

1.3.6足跖局部注射MOR拮抗劑實驗

為驗證DRG上調的MOR是否參與慢性炎性痛的調節，我們在正常大鼠和CFA慢性炎性痛大鼠足跖局部注射MOR拮抗劑。實驗分為模型+生理鹽水組、模型+MOR拮抗劑組、正常+MOR拮抗劑組，模型MOR拮抗劑組和正常+MOR拮抗劑組大鼠在造模后第18天在大鼠足跖局部注射4 μg MOR拮抗劑，模型對照+生理鹽水組大鼠足底內注射相同劑量0.05 mL生理鹽水。檢測注射生理鹽水或MOR 拮抗劑之前及注射后30 min的痛閾。

1.3.7統計方法

統計分析采用SPSS 16.0，實驗數據以均數±標準誤(mean±SEM)表示。兩組比較采用t檢驗。實驗處理前后的統計用配對T檢驗。P<0.05作為差異有統計學意義的檢驗標準。

2結果

2.1CFA大鼠痛閾水平

如圖1所示，兩組大鼠基礎痛閾無顯著差異(P> 0.05)。CFA足底注射后大鼠足跖出現明顯紅、腫(彩插4圖2)，CFA注射后顯著降低大鼠痛閾，在第18天，痛閾依然顯著低于正常組大鼠(P< 0.01)。

注：與正常組比較， **P< 0.01。 圖1　CFA大鼠患側PWL水平 Note: Compared with normal group,**P < 0.01. Fig.1　Ipsilateral paw PWL level of CFA model rats

2.2CFA大鼠患側L5DRG MOR陽性細胞表達水平

采用免疫組織化學法檢測大鼠患側L5DRG MOR陽性細胞表達。CFA大鼠患側L5DRG MOR陽性細胞表達情況(彩插4圖3)。如圖4所示，與正常組比較，CFA組大鼠患側L5DRG MOR陽性細胞表達增多44.79%(P< 0.01)

注：與正常組比較， **P < 0.01。 圖4　CFA模型大鼠患側L 5 DRG MOR 陽性細胞表達水平 Note: Compared with normal group, **P < 0.01. Fig.4　Ipsilateral L 5 DRG MOR expression of CFA model rats

2.3足跖背部注射MOR激動劑對大鼠痛閾的作用

如圖5A示：在CFA造模后18 d，足跖背部注射MOR激動劑之前，兩組大鼠痛閾無顯著差異(P> 0.05)；足跖背部注射MOR激動劑之后，與模型+生理鹽水組比較，模型+MOR激動劑組大鼠痛閾顯著提高27.95%(P< 0.01)。如圖5B示：在CFA造模后18 d，CFA模型大鼠足跖背部注射MOR激動劑能顯著提高CFA模型大鼠的痛閾(P< 0.01)，正常大鼠足跖背部注射MOR激動劑則對正常大鼠痛閾無顯著影響(P> 0.05)。

注： A：與模型+生理鹽水組比較， **P < 0.01； B：注射MOR激動劑之后與注射MOR激動劑之前比較， ##P < 0.01。 圖5　足跖背部注射MOR激動劑對大鼠痛閾的作用 Note: A. Compared with model+saline group, **P < 0.01； B.Compared with before injection of MOR agonist, ##P < 0.01. Fig.5　The effect of paw dorsal surface injection of MOR agonist on PWL

2.4足跖背部注射MOR拮抗劑對大鼠痛閾的作用

如圖6A示：在CFA造模后18 d，足跖背部注射MOR拮抗劑之前，兩組大鼠痛閾無顯著差異(P> 0.05)；足跖背部注射MOR拮抗劑之后，與模型+生理鹽水組相比，模型+MOR拮抗劑組大鼠痛閾顯著降低29.21%(P< 0.01)。如圖6B：在CFA造模后18 d，CFA模型大鼠足跖背部注射MOR拮抗劑能顯著降低CFA模型大鼠的痛閾(P< 0.01)，正常大鼠足跖背部注射MOR拮抗劑則對正常大鼠痛閾無明顯影響(P> 0.05)。

注：A：與模型+生理鹽水組比較， **P < 0.01； B：注射MOR拮抗劑之后與注射MOR拮抗劑之前比較， ##P < 0.01。 圖6　足跖背部注射MOR拮抗劑對大鼠痛閾的作用 Note: A. Compared with CFA+saline group, **P<0.01； B.Compared with before injection of MOR antagonist, ##P<0.01. Fig.6　The effect of paw dorsal surface injection of MOR antagonist on PWL

3討論

CFA模型是炎性痛的經典模型，在造模后1 d即可出現足跖局部的紅、腫、熱痛覺過敏等類似臨床炎性痛的癥狀和體征[9]。本研究中足底注射CFA 18 d后，模型大鼠熱痛覺過敏依然存在；應用免疫組化方法發現造模18 d后模型大鼠患側L5DRG的MOR陽性細胞數明顯高于正常對照組。阿片受體作為疼痛調節的重要受體之一，主要分布在較細的DRG神經元、C纖維和Aδ纖維[10-11]，與疼痛信號的產生、傳遞和調節密切相關，在炎性痛調制中起著重要作用。已有研究表明炎癥時DRG MOR的表達增強[13-15]，通過軸突轉運，阿片受體可從DRG轉運至神經元末梢[16-17]。這些表明，慢性炎癥本身可引起DRG神經元MOR的上調，這些神經可塑性變化是否對慢性炎性痛發揮著負反饋調節作用有待明確。

通過本研究證實，在炎癥局部注射MOR激動劑可產生鎮痛作用，注射MOR拮抗劑則使疼痛加劇，而在正常大鼠足跖局部注射MOR激動劑或拮抗劑對大鼠痛閾無明顯影響。結果提示慢性炎癥本身引起的DRG神經元MOR上調，可能有助于防止疼痛進一步加重，對炎性痛起著負反饋的調制作用。其可能機制是炎癥上調DRG MOR表達，并促進阿片受體軸突轉運至初級傳入神經元末梢，使得內源性阿片類物質更易與初級傳入神經元上的阿片受體接近，激活與阿片受體耦聯的Gi/Go蛋白，抑制腺苷酸環化酶活性，使cAMP減少，或者通過抑制鈣通道，從而使得Ca2+內流減少，K+外流增加，使得傳導痛覺信息的神經元興奮性降低，從而抑制疼痛傳遞[18]；或者進一步抑制感覺神經末梢釋放P物質、降鈣素基因相關肽和其它傳遞傷害性信息的神經遞質，從而抑制疼痛進一步加重[19]。

綜上所述，慢性炎性痛時，DRG神經元MOR表達上調，可能參與慢性炎性痛的負反饋調制。DRG神經元中阿片受體的上調，為局部應用阿片激動劑產生鎮痛作用提供基礎。我們的研究結果將為臨床上阿片類藥物的外周局部用藥以提示，更為重要的是阿片類藥物的外周鎮痛作用的發現使開發不透過血腦屏障、避免中樞副作用的鎮痛作用成為可能。

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〔修回日期〕2014-11-21