球囊損傷聯合高脂及維生素D3致大鼠動脈粥樣硬化的方法學優化

研究報告

球囊損傷聯合高脂及維生素D3致大鼠動脈粥樣硬化的方法學優化

楊欽欽，馬全鑫，奚曉青，張利棕，方明筍，朱科燕，陳方明，陳民利

(浙江中醫藥大學動物實驗研究中心/比較醫學研究中心，杭州310053)

【摘要】目的比較腹腔注射維生素D3 (VD3)1、2、3周后實行球囊手術對動脈粥樣硬化形成的影響，探尋大鼠動脈粥樣硬化造模的優化方法。方法選取雄性SD大鼠36只，隨機分為正常組、模型組1、模型組2、模型組3，正常組6只，其余每組10只。對照組飼喂普通飼料，模型組1、2、3在實驗開始時飼喂高脂飼料并腹腔注射VD3 40萬IU/kg，分別于1、2、3周后行左側頸總動脈球囊損傷手術，術后第0、2周再注射VD310萬IU/kg。手術4周后，處理動物，測定TG、TC、HDL-C、LDL-C水平，檢測血清中炎癥因子hsCRP、IL-6、TNFα含量，觀察HE染色的胸主動脈病理變化，分析血管壁厚度、斑塊面積(PA)、血管橫截面積(CVA)及校正斑塊面積(PA/CVA)。結果與正常對照組相比，模型組2、3中TC、LDL-C含量顯著升高(P<0.05)；模型組1、2、3的hsCRP、IL-6及TNFα水平較對照組明顯升高(P<0.05)，模型組3的hsCRP、IL-6及TNFα水平明顯高于模型組1(P<0.05)；病理觀察顯示模型組1、2、3均出現不同程度的AS斑塊，血管壁厚度及PA/CVA均顯著大于對照組(P<0.05)；模型組3有大量脂質泡沫沉積，而且PA、CVA及PA/CVA相比于模型組1、2均明顯增加(P<0.05)。結論大鼠在高脂飲食和VD3腹腔注射基礎上于3周后行頸總動脈球囊損傷手術，是誘導動脈粥樣硬化模型的理想優化方法。

【關鍵詞】球囊損傷；高脂；維生素D3；動脈粥樣硬化

[基金項目]國家科技重大專項子課題(2012zx09103101-008)。

[作者簡介]楊欽欽(1988-)，女，碩士生，研究方向：中藥藥理與比較醫學，E-mail: qqy_mengxiangz8@163.com。

[通訊作者]陳民利(1963-)，女，教授、碩士，研究方向：實驗動物與比較醫學，E-mail: cmli991@126.com。

【中圖分類號】R332【文獻標識碼】 A

doi:10.3969.j.issn.1671.7856. 2015.001.006

Methodological research of establishing atherosclerosis

model with ballon injury plus high-fat diet and vitamin D3in rats

YANG Qin-qin，MA Quan-xin，XI Xiao-qing，ZHANG Li-zong，FANG Ming-sun，ZHU Ke-yan，CHEN Fang-ming，CHEN Min-li

(Laboratory Animal Research Center, Zhejiang Chinese Medical University, Hangzhou 310053, China)

Abstract【】ObjectiveTo compare the effects of forming atherosclerosis by conducting ballon injury operation after 1th, 2th and 3th week of Vitamin D3(VD3) i.p., exploring the best method for atherosclerosis modeling. Methods 36 male rats were selected for balloon-injured carotid artery. SD rats were divided into 4 groups randomly: control group (n=6), Model group1 (n=10), Model group2(n=10), Model group3 (n=10). Control group were fed up with common diet. Model groups were fed up with high-fat diet and injected 4.0×105IU/kg VD3 through enterocoelia in the beginning, followed by the balloon-injured left carotid artery operation after 1th, 2th and 3th week respectively and 1.0×105IU/kg VD3 injection at 0th, 2th week after operation. The rats were killed at 4th week after operation. The serum levels of TG, TC, HDL-C and LDL-C were checked. ELISA was used to detect the content of hsCRP, IL-6 and TNFα. HE staining was used to observe the pathological changes in the thoracic aorta, and the thoracic aorta thickness, plaque area(PA), cross-sectional area of vessel(CVA) and the ratio of PA to CVA(PA/CVA) were analyzed. ResultsAfter 4 weeks of operation, levels of TC and LDL-C were significantly increased in Model group2 and 3 compared with that of the control group (P<0.05). Furthermore, contents of hsCRP, IL-6 and TNFα of model groups were also seriously higher than that of the control group (P<0.05), and that of Model group 3 were the highest. Typical AS plagues were observed in different degrees in model groups, and thoracic aorta thickness and PA/CVA were obviously increased than that of control group (P<0.05). Model group 3 turned out masses of lipid foam cells accumulated, and PA, CVA and PA/CVA were significantly increased than that of Model group2 or 3. Conclusion The AS model can be established successfully in rats with ballon injury after 3 weeks of high-fat diet plus VD3 i.p., which is the ideal method to induced atherosclerosis model.

【Key words】Balloon injury；High-fat diet;Vitamin D3；Atherosclerosis

動脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)是一種慢性動脈炎癥性疾病，可引發多種心血管疾病，嚴重威脅人類生命健康。因此，建立一種脂質代謝和斑塊與人類相仿的實驗性AS模型，對探明病因、發病機制及防治均具有重要意義。高脂飼喂、維生素D3(vitamin D3，VD3)注射和球囊損傷術是常用的一種AS造模手段，其原理是基于“內皮損傷反應學說”球囊直接損傷了大鼠動脈內皮，脂質易于浸潤沉積，符合臨床AS疾病的發生發展過程，可形成與人類AS類似的較成熟斑塊硬化AS模型[1]。內膜損傷能造成內膜脫落，同時給予高脂飼料及VD3負荷促使脂質及鈣鹽沉積，加速大鼠AS的形成[2]。但目前，各類文獻報道的方法不一，VD3注射劑量、注射時間以及行球囊手術的時間不盡相同，形成的AS模型也有差異。我們在前期研究發現VD3腹腔注射劑量、時間、注射方式及實行球囊手術的時間直接影響AS的形成。為此，我們在前期研究的基礎上結合相關參考文獻[3]，將高脂飼喂、VD3注射和球囊損傷術聯合應用的造模方法進行了優化研究。

1材料和方法

1.1實驗動物及實驗環境

SPF級雄性SD大鼠36只，體重220～250 g，購自上海斯萊克實驗動物有限公司【SCXK(滬)2012-0002】；飼養在浙江中醫藥大學動物實驗中心屏障系統【SYXK(浙)2013-0184】，每籠3只飼養，自由飲食和飲水；并按實驗動物使用的“3R”原則給以人道主義關懷。

1.2主要試劑與儀器

維生素D3注射液，上海通用藥業股份有限公司，國藥準字H31021404；總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白(HDL-C)、低密度脂蛋白(LDL-C)，上海申能德賽診斷技術有限公司，批號分別為07068/00000877、07069/00000994、18890/00001066、18991/00001244；大鼠白細胞介素6(IL-6)ELISA試劑盒、大鼠超敏C反應蛋白(hs-CRP)ELISA試劑盒、大鼠腫瘤壞死因子α(TNFα)ELISA試劑盒，杭州誠維生物科技有限公司，批號分別為：E2014082604、E2014082602、E2014082603。PTCA球囊擴張導管(直徑2F，美國Medronic公司)，7020型全自動生化分析儀(日本日立公司)，Thermo光譜掃描多功能酶標儀(美國Thermo公司)，ST5010染色機(德國Leica公司)，80I相差顯微鏡(日本Nikon公司)。

1.3實驗方法

1.3.1動物分組與模型制備

36只雄性SD大鼠，經適應性飼養后，隨機分為4組，即正常對照組(control group)6只、模型組1(model group 1)10只，模型組2(model group 2)10只和模型組3(model group 3)10只。正常對照組喂普通飼料。模型組在實驗開始時均以高脂飼料(膽固醇1%、豬油10%、蛋黃粉10%、3號膽鹽0.5%、基礎飼料78.5%)喂養，同時在腹腔注射40萬IU/kg的VD3注射液。之后，模型組1、2、3分別于VD3注射1、2、3周后行大鼠主動脈球囊損傷術，在術后第0、2周分別注射10萬IU/kg VD3注射液。

1.3.2大鼠主動脈內膜球囊損傷手術[4-5]

模型組大鼠用3%的戊巴比妥鈉(45 mg/kg)腹腔麻醉，頸部剃毛，背部固定于鼠板。碘酒消毒頸部皮膚，無菌條件下作頸部正中開口，鈍性分離大鼠左側頸總動脈，結扎遠心端，動脈夾夾閉近心端，暫時阻斷左側頸總動脈近心及遠心端血流。在兩端之間的動脈壁上約呈45°顯微剪剪開一“V”形開口，向近心端仔細輕柔插入2.0 mm×20 mm直徑球囊導管，松開動脈夾，使球囊進入近心端動脈，并向頸總動脈起始部推送8～10 cm。手推式壓力泵注入生理鹽水，將球囊充盈，用4～6 ATM加壓球囊，然后，回抽球囊(以回來時有明顯阻力感，又可以拉動球囊為宜)，當球囊回撤至切口處時球囊完全減壓，然后再將球囊導管推送入主動脈，再次充盈球囊、回撤減壓，使之與動脈內膜摩擦，造成內膜機械損傷。如此來回摩擦5次后，釋放球囊氣體，退出導管，結扎近心端頸總動脈。然后，生理鹽水沖洗傷口，并灑上青霉素鈉以防感染，縫合肌肉和皮膚，碘酒再次消毒皮膚，將動物放入護理框中保暖護理待其蘇醒。術后，每天觀察各模型組動物狀況且每周稱重，高脂飼料繼續喂養4周。

1.3.3血清中血脂檢測

球囊手術后第4周實驗結束，各組動物禁食12 h后，用3%戊巴比妥鈉(45 mg/kg)腹腔麻醉，打開腹腔， 腹主動脈取血10 mL，靜置30 min，3000 r/min離心10 min，取上清分成3份，其中一份用全自動生化儀測定TG、TC、HDL-C、LDL-C數值。另外兩份置-80℃冰箱中凍存備用。

1.3.4血清中炎癥因子hsCRP、IL-6、TNF-α檢測

取一份-80℃中凍存的血清，采用雙抗體一步夾心法酶聯免疫吸附法(ELISA)分別測定上清液中hsCRP、IL-6和TNF-α的含量。

1.3.5血管組織病理學觀察及主動脈內膜增生的檢測

術后第4周取材，動物麻醉取血后，暴露出心臟及整條主動脈，取出胸主動脈(損傷部位主動脈弓下面一段血管)約1.0 cm，生理鹽水沖洗干凈。然后，將標本置于4%甲醛溶液中固定1～2 d，石蠟包埋后行病理切片，HE染色后在光鏡下觀察血管病理形態學改變情況。同時，觀察內膜增生程度及斑塊形成情況，采用Image Pro Plus 6.0專業圖像分析軟件進行分析，計算血管壁厚度、斑塊面積(PA)、血管橫截面積(CVA)及校正斑塊面積(PA/CVA)。

1.4統計學方法

2結果

2.1一般狀況

本實驗中共26只大鼠，有6只大鼠死亡，手術中死亡4只，均因胸腔血管破裂出血致死；術后死亡2只，其原因可能是手術中出血較多恢復力較差而死。其中模型組1在手術中死亡3只，手術后死亡1只；模型組2在手術中及手術后各死亡1只；模型組3動物全部存活。正常對照組無死亡，動物精神狀態良好，毛色較白有光澤，進食量穩定，行為活躍。模型組動物毛色偏黃粗糙，體型較正常組肥胖，少動，精神欠佳，飲食尚可。

2.2血脂水平

與正常對照組相比，模型組1、2、3大鼠在球囊手術四周后血清TC顯著升高(P<0.05)；各模型組血清LDL-C水平較對照組明顯上升(P<0.05)；模型組1、3血清HDL-C較對照組顯著降低(P<0.05)，模型組2無顯著變化(P>0.05)；各模型組血清TG水平與正常對照組相比有升高的趨勢，但無顯著性差異(P>0.05)(表1)。

2.3血清中hs-CRP、IL-6、TNFα含量檢測

與正常對照組相比，各模型組大鼠血清hs-CRP、IL-6、TNFα含量均顯著升高(P<0.05)。與模型組1相比，模型組3血清中hs-CRP、IL-6、TNFα含量均顯著增加(P<0.05)，模型組2無顯著性差異(P>0.05)(圖1)。

2.4主動脈病理學變化

2.4.1胸主動脈組織學觀察(彩插均見彩插1)

胸主動脈HE染色顯示，正常組大鼠血管管腔呈光滑橢圓形，血管壁分為內膜、中膜和外膜，三層界限清晰，內膜平整完好，血管組織結構正常，未見明顯病理改變(圖2A、A1)。與正常組相比較，各個模型組胸主動脈均見典型的AS斑塊形成。模型組1大鼠血管內膜輕微增生，管腔略狹窄，斑塊中可見一定的泡沫細胞、脂質沉積和膽固醇結晶(圖2B、B1)。模型組2大鼠血管內膜比模型組1增生較嚴重，彈力纖維排列疏松，斑塊突入管壁致管腔更狹窄，有較多的泡沫細胞和脂質沉積(圖2C、C1)。模型組3的內膜增生程度及管腔狹窄度最大，內彈力板排列紊亂變性壞死，脂質斑塊內可見大量泡沫細胞聚集、膽固醇晶體沉積及炎癥細胞浸潤，脂核相對較大(圖2D、D1)。

2.4.2胸主動脈內膜增生情況

與正常對照組相比較，球囊手術4周后，各個模型組大鼠的胸主動脈厚度、CVA顯著增加(P<0.05)。與模型組1相比較，模型組2、3的胸主動脈厚度、PA、CVA及PA/CVA均明顯升高(P<0.05)。模型組3相比于模型組2，其胸主動脈厚度、PA、CVA及PA/CVA亦顯著增加(P<0.05)(表2)。

表1　各組大鼠術后4周血脂水平變化(mmol/L)

注：*：與正常對照組相比，P<0.05。

Note: Compared with the control group,P<0.05.

注： *：與正常對照組相比，P<0.05； #：與模型組1相比，P<0.05。 圖1　血清中hs-CRP、IL-6、TNFα含量比較 Note: *: Compared with the control group, P<0.05; #: compared with the model group 1, P<0.05. Fig.1　Comparison of the content of hs-CRP, IL-6, TNFα in serum

組別(Groups)胸主動脈厚度(μm)Thoracicaortathickness(μm)PA(mm2)CVA(mm2)PA/CVA(%)正常對照組(Controlgroup)114.19±1.37—0.63±0.01—模型組1(Modelgroup1)132.28±0.46a0.033±0.0020.72±0.13a4.58±0.24模型組2(Modelgroup2)149.16±2.10ab0.086±0.010b0.79±0.23ab10.92±1.35b模型組3(Modelgroup3)165.25±1.61abc0.116±0.004bc0.82±0.17abc14.13±0.51bc

注：a：與正常對照組相比，P<0.05；b：與模型組1相比，P<0.05；c：與模型組2相比，P<0.05。

Note: a: Compared with the control group,P<0.05; b: compared with the model group 1; c: compared with the model group 2,P<0.05.

3討論

高脂飼料、VD3腹腔注射聯合頸總動脈球囊損傷方法建立AS模型已較多地應用于AS研究[2]，但各類文獻報道的VD3注射劑量、注射時間等不盡相同，對VD3注射后行球囊手術的時間也缺乏統一認識[6-7]，而這些因素的改變都會導致AS的病理進程產生差異。我們前期研究發現在VD3腹腔注射后不同時間實行球囊手術，AS形成的程度也不同。由此可知AS模型的形成與各實驗因素相關，本實驗主要從VD3注射劑量、注射方式(注射時間與分次劑量)、手術時間等方面對AS模型制作進行了優化。文獻報道一次性注射大劑量VD37.0×104IU/kg會引起動物腹瀉、厭食消瘦、死亡率升高等[8]，我們將VD3首次注射劑量優化為4.0×104IU/kg，動物狀態普遍良好；周紅等[3]發現在造模初期僅一次注射VD3會導致AS模型不明顯、不易形成典型的血管病變，我們在術后第0、2周繼續分次補充注射VD3，提高了模型成功率；本實驗將VD3注射后第1、2、3周做球囊損傷手術動物經對比發現注射VD3后第3周行頸動脈球囊手術可降低動物的死亡率，AS模型較為理想和穩定；大鼠術后立即采取保暖、補水、注射抗生素、祛痰等護理措施，遵從了動物福利原則，有利于動物恢復并提高了大鼠的成活率。

AS的發生與血脂異常密切相關。本實驗結果顯示各模型組大鼠在球囊手術4周后血清TG、TC和LDL升高，HDL降低，這與佘顏等[9]報道的實驗結果相符，表明各模型組動物血脂代謝出現了紊亂。其中模型組3的血脂異常更為明顯。通過病理觀察進一步發現各模型組均形成了不同程度的粥樣斑塊，內膜普遍增厚，血管壁斑塊向管腔突出，斑塊中含有泡沫細胞、平滑肌細胞、膽固醇結晶及炎癥細胞。而模型組3內膜增厚的幅度最大，形成的斑塊也最為明顯。從血脂及病理形態學結果可看出在VD3注射后1、2、3周行球囊手術均能形成AS模型，而且在VD3注射后第3周行球囊手術則更有利于血脂沉積及斑塊形成。

近來研究表明AS主要是在血管內皮細胞損傷的基礎上發生的一系列慢性炎癥反應[10-12]，其中IL-6、TNFα、hsCRP已作為AS發展過程中的重要炎癥標志物[13-14]。本實驗結果顯示各模型組大鼠術后4周血清hsCRP、IL-6、TNFα含量均顯著升高，說明在VD3注射后第1、2、3周行球囊手術的動物均出現了明顯的炎癥反應。此外，我們發現VD3注射后第3周行球囊手術大鼠血清中炎癥介質含量最高，在這長期慢性炎癥刺激下平滑肌細胞(SMC)大量遷移增殖，血管壁大幅增厚及泡沫細胞增多，更能促進AS斑塊演變發展。故我們推論在腹腔注射VD3后第3周行球囊手術更好，更有利于AS模型的建立。

綜上所述，以高脂飼料為誘導聯合腹腔注射VD3和球囊手術的方法成功復制出了斑塊成熟的AS模型。本實驗研究結果表明，在大鼠腹腔注射VD33周后進行球囊手術并在術后第0、2周繼續腹腔注射VD3是一個較為優化的AS造模方法。該模型具有血脂高、炎癥反應程度高、斑塊明顯、動物死亡率低、模型穩定等優點。

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〔修回日期〕2014-11-24