兩種培養基誘導人和大鼠脂肪干細胞向脂肪細胞分化的比較

研究報告

兩種培養基誘導人和大鼠脂肪干細胞向脂肪細胞分化的比較

曹蕊，呂濤，嚴笠，孫雪健，肖苒

(中國醫學科學院整形外科醫院研究中心，北京100144)

【摘要】目的比較兩種培養基誘導人和大鼠脂肪干細胞(adipose-derived stem cell, ADSC)的成脂分化能力，探尋更為適宜的ADSC成脂誘導方案。方法提取3例臨床患者的脂肪干細胞(hADSCs)及出生6周大鼠的脂肪干細胞(rADSCs)，將hADSCs、rADSCs分別接種于六孔板，分為未誘導組、成脂誘導I組和II組，分別使用普通培養基、成脂誘導培養基I和II，培養10 d后以油紅O染色，鏡下觀察及檢測490 nm吸光度值(A490)，比較脂滴形成情況。結果未誘導的hADSCs和rADSCs均呈成纖維細胞樣生長，成脂誘導培養3 d后出現脂滴；油紅O染色顯示，成脂誘導組脂滴呈橘紅色，hADSCs和rADSCs的成脂誘導II組形成的脂滴均明顯大于誘導I組，統計學分析顯示hADSCs的成脂誘導II組測得的A490明顯高于誘導I組(P<0.01); 而兩組的rADSCs的A490無明顯差異(P>0.05)。結論 hADSCs和rADSCs在兩種誘導培養基中均可成脂分化，但成脂誘導II組優于成脂誘導I組。

【關鍵詞】人脂肪干細胞；大鼠脂肪干細胞；成脂誘導

[基金項目]國家自然科學基金(編號:81171817 / 30871433)。

[作者簡介]曹蕊 (1966- )，女，主管技師,研究方向：細胞生物學。E-mail: caorui660428@sina.com。

[通訊作者]肖苒 (1971-)， 女，教授，研究方向：干細胞與組織工程基礎及應用研究E-mail: rxiao163@163.com。

【中圖分類號】R33【文獻標識碼】 A

doi:10.3969.j.issn.1671.7856. 2015.002.005

Comparison of adipogenic differentiation ability of adipose stem

cells derived from humans and rats using two kinds of

adipogenic culture media

CAO Rui, LV Tao,YAN Li, SUN Xue-Jian, XIAO Ran

(Research Center of Plastic Surgery Hospital, Chinese Academy of Medical

Sciences & Peking Union Medical College, Beijing 100144, China)

Abstract【】ObjectiveTo find a more appropriate method of adipogenic induction for adipose stem cells derived from humans and rats by comparing their adipogenic differentiation ability using two kinds of adipogenic culture media. Methods The human adipose stem cells (hADSCs) were extracted from lipoaspirates of 3 donors in the clinic, and the rat adipose stem cells (rADSCs) were obtained from adipose tissues of 6-week old rats. The cells were plated into two 6-well plates, and were divided into 3 groups: the negative control group, adipogenic induction group I and group II, respectively, two wells in each group. The control medium, adipogenic induction medium I and medium II were added into the cells of different groups, respectively. After induction for 10 days, the adipogenic differentiation ability of cells was assessed under microscope with oil red O staining and detecting the optical density value of 490 nm (A 490 nm) to compare the lipid droplet formation in the cells. Results The hADSCs and rADSCs showed a fibroblast-like growth. Positive oil red O staining cells showed orange lipid in the cells of adipogenic induction group from the third day of culture. The amount of lipid in cells induced by adipogenic induction medium II was higher than that in cells induced by adipogenic induction medium I, the A490 nm optical density of hADSCs induced by adipogenic induction medium II was significantly higher than that induced by adipogenic induction medium I (P<0.01), but there was no significant difference between the rADSCs induced by adipogenic induction medium I and II (P>0.05). ConclusionsBoth hADSCs and rADSCs can be induced to adipogenic differentiation using the two kinds of induction media, however, the induction of adipogenic differentiation ability of the adipogenic induction medium II is stronger than that of the adipogenic induction medium I.

【Key words】Adipose derived stem cells, humam; Adipose derived stem cells, rat;Adipogenic differentiation; Cell culture

脂肪干細胞(adipose-derived stem cells, ADSCs)是來源于脂肪組織的間充質干細胞，多項研究已證實ADSCs有很強的自我復制和多向分化的潛能，能被誘導分化為骨、軟骨、脂肪等多種細胞，并且取材方便，能在體外大量擴增，與骨髓間充質干細胞(bone marrow stem cells, BMSCs)相比，ADSCs更易獲得足夠的細胞數量且對患者損傷小，是更理想的間充質干細胞源，在組織工程和臨床治療中具有很大的應用潛能[1]。本實驗通過對hADSCs和rADSCs在兩種成脂誘導培養基中成脂分化能力進行比較，為脂肪干細胞成脂誘導提供更理想的誘導方法。

1材料和方法

1.1實驗對象

人脂肪干細胞來源于3例女性臨床吸脂患者，平均年齡35歲。大鼠脂肪干細胞來源于出生6周的SD大鼠，本實驗用SD大鼠來自中國人民解放軍軍事醫學科學院動物中心,許可證號SCXK-(軍)2012-0004。

1.2主要試劑及儀器

DMEM高糖培養基(Gibco)、胎牛血清(Gibco)、青鏈霉素(Hyclone)、I型膠原酶(Sigma)、胰蛋白酶(Hyclone)、羅格列酮(Sigma)、生物素(Sigma)、泛酸(Sigma)、3-異丁基-1-甲基黃嘌呤(IBMX)(Sigma)、胰島素(Sigma)、吲哚美辛(Sigma)、地塞米松(Sigma)。主要儀器：二氧化碳孵箱、倒置顯微鏡、酶標儀。

1.3培養基配方

普通完全培養基：DMEM高糖、10%胎牛血清、1%青鏈霉素。成脂誘導培養基Ⅰ(100 mL)[1]：DMEM高糖、10%胎牛血清、1%青鏈霉素、IBMX 0.5 mmol/L、胰島素 10 μmol/L、吲哚美辛 200 μM、地塞米松10 nmol/L。成脂誘導培養II (100 mL)[7]：DMEM高糖、10%胎牛血清、1%青鏈霉素、 胰島素1 μmol/L、IBMX 0.5 mmol/L、地塞米松20 nmol/L、羅格列酮5 μmol/L、生物素33 μmol/L、泛酸17 μmol/L。

1.4實驗方法

1.4.1大鼠ADSCs體外分離培養：取出生6周的SPF級SD大鼠數只，頸椎脫臼處死后，浸于75%酒精消毒10 min，解剖切取雙側腹股溝皮下脂肪墊，放入含有1%青-鏈霉素的PBS中，剔除小血管及筋膜，再將脂肪組織剪成1 mm3小塊，用PBS洗3遍后，加入等體積0.1% I型膠原酶溶液，在搖床上37℃消化(30～40)min，加入含10% FBS低糖DMEM終止消化，輕輕吹打數次混勻，以1 000 r/min離心5 min，棄去上層油脂及上清液，加入適量PBS吹打離心管中的沉淀物，再以1 000 r/min離心5 min，棄上清液，以含10% FBS的低糖DMEM培養基重懸細胞后，接種于培養皿中，于37℃、5% CO2培養箱中培養，(24～48)h首次換液，以后每3 d換液1次并在倒置顯微鏡下觀察細胞狀態及生長情況。

1.4.2人ADSCs體外分離培養:將人脂肪抽吸組織用無菌的PBS沖洗3遍，洗去血液和麻藥，記錄剩余組織的體積，在其中加入終濃度為0.75 g/L的I型膠原酶，37℃消化30 min，加入含10%胎牛血清的DMEM培養基，中和膠原酶的消化作用，1 000 rpm/min離心5 min，棄上清液，加入培養基重懸細胞，將細胞懸液分裝入培養皿，37℃、5%的CO2條件下培養。24 h后全量換液，去除未貼壁的細胞，以后每3 d換液1次，倒置顯微鏡下觀察細胞生長情況和形態。

1.4.3成脂誘導及檢測：將第3代的hADSCs、rADSCs分別以5×104/孔各接種一個六孔板，孵育24 h后將每塊六孔板分3組(2孔一組)，分別為未誘導組、成脂誘導I組和成脂誘導II組，待細胞長到70%時，分別換成普通培養基、成脂誘導培養基I和成脂誘導培養基II，3 d換液1次。培養10 d后進行油紅O染色并采用分光光度計檢測490 nm時的吸光度值，對hADSCs、rADSCs用兩種不同誘導方法進行成脂誘導后分化能力進行比較。

1.4.4油紅O染色具體步驟：在成脂誘導10 d后將培養皿中培養基吸出，用PBS洗兩遍后，加入4%多聚甲醛室溫固定30 min，吸出固定液后加入油紅O染液，室溫孵育20 min，用60%異丙醇快速洗1遍，然后再用蒸餾水洗2遍。顯微鏡下觀察細胞成脂分化情況。以異丙醇溶解染色后的成脂細胞，搖床振蕩10 min，490 nm測吸光度。

1.4.5統計學方法:采用SPSS (Version 17.0)軟件，用獨立樣本t檢驗(Independent-Samplesttest)對檢測結果進行統計學分析，當P<0.05時認為差異有統計學意義。數據以均數±標準差(mean ± s)表示。

2結果

2.1原代及傳代細胞鏡下觀察

細胞最初接種時呈圓形透亮的單個細胞懸浮于培養液中，24 h后部分已貼壁，呈短梭形，(2～3)d貼壁細胞逐漸增多，形成許多大小不等的集落，向四周擴散，細胞逐漸呈長梭形或多角形，(6～7)d集落中細胞數量增加，集落之間互相融合，逐漸鋪滿瓶底后，可進行傳代，傳代細胞增殖迅速，(2～4)h開始貼壁，24 h完全貼壁，(3～5)d可達80%匯合(圖1，見文后彩插4)。

2.2hADSCs成脂誘導分化結果

未誘導組無脂滴形成，兩成脂誘導組細胞均有不同程度的橙紅色脂滴形成，成脂誘導II組中細胞形成的脂滴明顯多于成脂誘導I組，并且脂滴大且飽滿，吸光度測試后統計學分析也表明成脂誘導液I和成脂誘導液II誘導細胞分化能力差異存在顯著性 (P<0.01)，因此成脂誘導II組細胞分化能力明顯優于成脂誘導I組(圖2見文后彩插4，圖3)。

2.3rADSCs成脂誘導分化結果

細胞分別在普通培養基、成脂誘導培養基I和成脂誘導培養基II中培養10 d后進行油紅O染色，鏡下觀察未誘導組無脂滴形成。兩誘導組細胞均有脂滴形成，成脂誘導II組細胞形成的脂滴較成脂誘導I組的脂滴大且飽滿；吸光度測試后統計學分析表明兩種誘導液中rADSCs成脂分化差異無顯著性(P>0.05)(見圖2,圖3)。

圖3　hADSCs、rADSCs成脂誘導10 d 后油紅O染色吸光度值比較 Fig.3　Comparison of the A490 nm optical density of hADSCs and rADSCs at 10 days after adipogenic induction. Oil red O staining

3討論

人和大鼠的脂肪組織均可分離脂肪干細胞，人脂肪組織通常來源于吸脂術，大鼠脂肪組織則取自腹股溝處的脂肪墊。有文獻報道在從脂肪組織中分離出的原代基質細胞中，成纖維樣細胞在數量上占有優勢，但仍混有少量的造血細胞、內皮細胞和平滑肌細胞。通過傳代，混雜細胞的比例迅速降低，傳至第3代時可以得到較純的脂肪干細胞(ADSCs)[2]。在體外培養過程中，ADSCs可以在很長時間內保持未分化狀態，具有成纖維細胞樣形態，胞內缺乏脂滴，但具有多向分化的潛能。體外培養hADSCs、rADSCs的過程中，隨著傳代培養，細胞形態由原代的不均一狀態逐漸形成均一的梭形，貼壁生長的細胞保持較為穩定的生物性狀，具有較強的增殖能力。經3代以上傳代后，細胞成分均一，直至12代，純度始終保持在95%以上，具有高度的同源性[3]，因此，本實驗均采用第3代細胞進行下一步的成脂分化實驗，這時的細胞生長旺盛，細胞狀態好，形態均一。

本實驗采用了兩種成脂誘導培養基，誘導培養基I是比較經典的成脂誘導配方[1]，培養成分包括地塞米松、胰島素、3-異丁基-1-甲基黃嘌呤(3-isobutyl-1-methylxanthine，IBMX)、吲哚美辛。研究顯示胰島素可以顯著提高細胞中甘油三酯合成和聚集的速率[4]；地塞米松屬于糖皮質激素，可以促進脂肪前體細胞的成脂分化[5]；IBMX是cAMP的非特異性抑制劑，而吲哚美辛屬于非甾體抗炎藥，可以抑制前列腺素合成，二者可以啟動成脂分化[6]。本實驗中又參考另一文獻[7]提供的配方配制了成脂誘導培養基II，配方中除有地塞米松、IBMX、胰島素外還包括泛酸、生物素及羅格列酮，其中的羅格列酮與PPAR受體結合增加脂肪細胞對胰島素的敏感性。泛酸和生物素是維生素B族，在脂肪合成過程中起重要作用[8]。在既往研究中，有研究者應用與成脂誘導培養基II成分類似的成脂誘導培養基誘導前脂肪細胞，采用不同誘導時間和步驟，導致不同的誘導效果[9]；也有研究者比較了與本實驗中成脂誘導培養基成分不同的其它培養基誘導月經血干細胞的成脂分化能力[10]。采用本實驗中成脂誘導培養基I和II分別誘導hADSCs和rADSCs的比較研究尚未見報道。將HADSCs分別用這兩種誘導培養基誘導分化，培養10 d后油紅O染色，鏡下觀察和吸光度檢測均證實成脂誘導培養基II誘導細胞成脂分化能力明顯好于成脂誘導培養基I，因此hADSCs更適宜用成脂誘導培養基Ⅱ誘導。rADSCs分別在兩種誘導培養基中培養后雖然針對其油紅O染色的吸光度檢測結果經統計學分析表明成脂分化能力沒有明顯差異，但鏡下觀察細胞在成脂誘導培養基II中培養形成的脂滴較誘導培養基I中形成的脂滴更為飽滿，脂滴團較大，比較而言rADSCs也適宜用成脂誘導培養基II誘導。因此，通過比較成脂誘導培養基II優于成脂誘導培養基I，更適宜hADSCs和rADSCs成脂誘導。

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〔修回日期〕2014-11-03