靈芝多糖對癲癇大鼠腦中谷氨酸轉運體的影響

·實驗研究·

靈芝多糖對癲癇大鼠腦中谷氨酸轉運體的影響

朱孔利，謝莉莉，劉輝

(南通衛生高等職業技術學校 ，江蘇 南通 226007)

摘要：目的觀察和探討靈芝多糖干預后戊四氮(PTZ)致癇大鼠皮質和海馬區興奮性谷氨酸轉運體(EAAT)GLAST (EAAT1)、GLT1 (EAAT2)、EAAC1(EAAT3)的變化,進一步研究癲癇的發病機制及靈芝多糖的作用機制。方法SD大鼠32只,隨機分為正常對照組、癲癇模型組、靈芝多糖組和卡馬西平組,每組8只。癲癇組、靈芝多糖組和卡馬西平組采用PTZ腹腔注射制作慢性癲癇點燃模型。實驗結束后斷頭迅速取腦,采用免疫組化法檢測皮質和海馬區各指標的變化。結果癲癇模型組大鼠腦中GLAST、GLT1、 EAAC1的表達較正常對照組降低：皮質(31.87±4.76)、( 48.00±5.34),( 42.87±4.01)、( 52.12±3.75),( 40.25±2.81)、(46.87±3.04)；海馬:(29.87±4.32)、( 44.51±4.81), (36.50±3.02)、( 47.00±3.20),( 35.62±3.42)、(42.12±3.56)；靈芝多糖和卡馬西平組大鼠腦中GLAST1、GLT1、 EAAC1的表達較癲癇模型組升高:皮質(40.50±4.47)、( 31.87±4.76),( 48.87±3.48)、( 42.87±4.01),( 43.87±2.53)、(40.25±2.81)；海馬:(37.75±3.61)、( 29.87±4.32),( 41.25±2.60)、 (36.50±3.02),( 39.50±2.61)、(35.62±3.42)。靈芝多糖組和卡馬西平組之間GLAST1、GLT1、EAAC1三者的表達無統計學意義。結論靈芝多糖能夠升高癲癇大鼠腦中GLAST、GLT1、EAAC1的表達，加速了興奮性氨基酸Glu(谷氨酸)的清除。降低神經元興奮性、減少神經系統損傷而抑制癲癇的發作。

關鍵詞：癲癇；谷氨酸轉運體；靈芝多糖

DOI:10.13463/j.cnki.cczyy.2015.06.002

中圖分類號：R285．5文獻標志碼：A

文章編號：2095-6258(2015)06-1104-03

基金項目：江蘇省衛生科研項目(JZ201319)。

作者簡介：朱孔利(1979-)，女，碩士，講師，主要從事癲癇的發病機制及預防研究。

收稿日期:(2015-05-26)

Ganoderma lucidum polysaccharide on excitatory amino acid transporter in brain of epileptic rat

ZHU Kongli, XIE Lili, LIU Hui

(Nantong Vocational and Technical College of Health, Nantong 226007, Jiangsu Province, China)

Abstract：ObjectiveTo observe and investigate the influence of ganoderma lucidum polysaccharide on GLAST, GLT-1 and EAAC1 in the cortex and hippocampus of epileptic rat. Study on the pathogenesis of epilepsy and the mechanism of action of ganoderma lucidum polysaccharide. MethodsThe 32 SD rats were randomly divided into normal control group, epilepsy model group, ganoderma lucidum polysaccharides and carbamazepine group, each group of eight. The rats of epilepsy model group, ganoderma lucidum polysaccharides and carbamazepine group made by intraperitoneal injection of pentetrazole (PTZ). After the experiment, get the rats brain tissue quickly. Using immunohistochemical and colorimetry to detect the index changes of cortex and hippocampus. ResultsGLAST1，GLT1， EAAC1 in the brain of epileptic rat lower in epilepsy model group than the normal control group:cortex(31.87±4.76),( 48.00±5.34),(42.87±4.01),(52.12±3.75),(40.25±2.81),(46.87±3.04);hippocampus(29.87±4.32),(44.51±4.81), (36.50±3.02),(47.00±3.20), (35.62±3.42),(42.12±3.56); GLAST, GLT-1, EAAC1 in the brain of epileptic rat higher in ganoderma lucidum polysaccharides group and carbamazepine group than the epilepsy model group:cortex(40.50±4.47),(31.87±4.76),(48.87±3.48),(42.87±4.01),(43.87±2.53),(40.25±2.81);hippocampus(37.75±3.61),(29.87±4.32),( 41.25±2.60),(36.50±3.02),(39.50±2.61),(35.62±3.42); GLAST1, GLT1, EAAC1 were no significant differences in ganoderma lucidum polysacchairides group and carbamazepine group. ConclusionGanoderma lucidum polysaccharide can increase the GLAST，GLT-1 and EAAC1 in the epileptic rats brain tissue, speed up the process of eliminating glutamic acid.

Keywords：epilepsy; EAAT; Ganoderma lucidum polysaccharide

癲癇是臨床上常見的神經系統疾病之一，腦部最主要的興奮性神經遞質 Glu(谷氨酸)的升高在癲癇發生中起一定作用，可導致神經元細胞凋亡。而細胞外Glu 的清除主要依賴于高親和力的興奮性氨基酸轉運體(EAATs)。迄今為止已克隆出5種位于細胞膜的興奮性谷氨酸轉運體(EAAT)，分 別 為 GLAST(EAAT1)、GLT-1 (EAAT2)、EAAC1(EAAT3)、EAAT4、EAAT5。靈芝含有豐富的氨基酸和微量元素，可通過免疫調節，抗氧化，清除自由基，抑制凋亡，增強學習記憶，營養神經等方面發揮抗癲癇作用。靈芝多糖由肽多糖、葡聚糖、雜多糖等多糖均一體組成的混合物，是靈芝主要有效成分之一[1]，本實驗擬研究靈芝多糖對癲癇大鼠大腦中GLAST、GLT1、EAAC1的影響，進一步探討癲癇的發病機制及靈芝多糖的作用機制。

1材料與方法

1.1材料1.1.1動物雄性SD大鼠32只(鼠齡12周)，體質量180～220 g，普通級動物，由南通大學醫學院動物實驗中心提供。1.1.2主要儀器與試劑戊四氮(PTZ)：美國sigma公司；靈芝多糖：上?？抵壅婢嗵怯邢薰?；兔抗大鼠GLAST、兔抗大鼠GLT-1和兔抗大鼠EAAC1均購自武漢博士德生物工程公司；成像系統：BI-2000醫學圖像分析系統(成都泰盟生物科技公司)。1.2方法1.2.1癲癇模型及動物處理大鼠適應喂養3 d后，隨機分為4組，分別為正常對照組、癲癇模型組、靈芝多糖組和卡馬西平組。灌胃前禁食6 h。癲癇模型組PTZ腹腔注射加生理鹽水灌胃；靈芝多糖組PTZ腹腔注射加靈芝多糖灌胃；卡馬西平組PTZ腹腔注射加卡馬西平混懸液灌胃；正常對照組生理鹽水腹腔注射加生理鹽水灌胃。腹腔注射劑量為35 mg/kg，靈芝多糖灌胃劑量為150 mg/kg，1 次/d，卡馬西平灌胃計量為15 mg/kg的混懸液，2次/d，持續28 d。觀察大鼠的行為變化，記錄癲癇發作情況。按照驚厥發作評分標準[2]，凡顯示連續5次Ⅱ級以上驚厥的大鼠為達到點燃標準。1.2.2免疫組織化學檢測 實驗動物麻醉后心臟灌注斷頭，取腦，甲醛固定、包埋、切片、封片，用于免疫組化。SABC法檢測皮質和海馬區GLAST、GLT-1和EAAC1的免疫反應性;正常組實驗省去第Ⅰ抗，以PBS代替，孵育切片。光鏡下觀察 ，胞膜顯示棕黃色顆粒者為陽性細胞。每張切片選擇 5 個具有代表性的高倍視野(×400)，計算染色的陽性細胞數。1.2.3統計學處理實驗中所得數據均以平均數±標準差(±s)表示，均數間顯著性差異判定使用SPSS Statistics 17．0統計軟件包進行分析。

2結果

2.1行為學觀察實驗過程中，癲癇模型組、靈芝多糖組和卡馬西平組實驗大鼠均有連續多次的Ⅱ～IV級癲癇發作，均達到點燃標準，癲癇模型制作成功。初期大鼠的癲癇發作基本上每次腹腔注射戊四氮后1～3 min出現，5～7 min 達到高峰，一般30 min后很少再有抽搐發作。靈芝多糖組和卡馬西平組大鼠癲癇發作潛伏期明顯延長，發作時間縮短。正常對照組生理鹽水腹腔注射及灌胃前后無明顯變化。2.2各組皮質和海馬區GLAST的表達見表1。

表1　大鼠大腦皮質和海馬區GLAST陽性細胞數比較( ± s, n=8)個/高倍視野

表1　大鼠大腦皮質和海馬區GLAST陽性細胞數比較( ± s, n=8)個/高倍視野

組 別皮 質海 馬正常組48.00±5.34##44.51±4.81##模型組31.87±4.76 29.87±4.32 靈芝組40.50±4.47# 37.75±3.61# 卡馬組38.12±4.22# 35.62±3.06#

注：與模型組比較，#P<0.05; ##P<0.01

2.3各組皮質和海馬區GLT-1的表達見表2。

表2　大鼠大腦皮質和海馬區GLT-1陽性細胞數比較( ± s, n=8)個/高倍視野

表2　大鼠大腦皮質和海馬區GLT-1陽性細胞數比較( ± s, n=8)個/高倍視野

組 別皮 質海 馬正常組52.12±3.75##47.00±3.20##模型組42.87±4.01 36.50±3.02 靈芝組48.87±3.48# 41.25±2.60# 卡馬組46.12±4.85# 38.12±3.09#

注：與模型組比較，#P<0.05; ##P<0.01

2.4各組皮質和海馬區EAAC1的表達見表3。

表3　大鼠大腦皮質和海馬區EAAC1陽性細胞數比較( ± s, n=8)個/高倍視野

表3　大鼠大腦皮質和海馬區EAAC1陽性細胞數比較( ± s, n=8)個/高倍視野

組 別皮 質海 馬正常組46.87±3.04##42.12±3.56##模型組40.25±2.81 35.62±3.42 靈芝組43.87±2.53# 39.50±2.61# 卡馬組44.62±2.13# 40.75±2.43#

注：與模型組比較，#P<0.05; ##P<0.01

3討論

谷氨酸轉運體與癲癇發作密切相關。用遺傳學手段高表達或者藥理學手段上調GLT-1的表達和功能可以增加谷氨酸的攝取能力并減輕谷氨酸引起的細胞死亡[3]。乳酸轉運體的減少可引起谷氨酸轉運體(EAAT1)的減少，導致腦內谷氨酸水平升高，提高神經元興奮性，導致癲癇發作[4]。研究[5]發現，星形膠質細胞中TSC1失活的小鼠腦中的GLT-1和GLAST蛋白量都明顯降低，同時表現出癲癇行為，可能是由于TSC1的失活導致谷氨酸轉運系統的紊亂，引起癲癇發作。7β-羥基膽固醇可抑制海馬區域膠質細胞增生、提高 GLAST 和 GLT1的表達，對創傷性癲癇起到治療作用[6]。癲癇大鼠顳葉皮層中 GLAST 和 GLT-1 在靜息期表達水平下調，嚴重影響 Glu 的清除機制，二者可能共同參與癲癇發生過程中的突觸重構，引起癲癇敏感性增加。癲癇持續狀態的大鼠海馬神經元遭受損傷，TBOA可阻滯GLAST 、GLT1和EAAC1 ，導致谷氨酸轉運體功能障礙，加重神經元損傷，對海馬區突觸的可塑性產生影響[7]。研究[8]顯示，EAAC1 在急性期和靜息期早期表達增加。而 SIMANTOV等[9]發現在癲癇大鼠海馬中 EAAC1 mRNA 及蛋白在癲癇早期表達呈下降趨勢。SEPKUTY等[10]研究證實大鼠 EAAC1 基因敲除后，導致Glu 轉運障礙，促使癲癇發生。Guo 等[11]發現 EAAC1 蛋白及 mRNA 的表達在SERs中無明顯變化。 本研究發現，戊四氮致癲癇大鼠皮質和海馬區GLAST、GLT-1、 EAAC1的表達水平明顯低于正常組，用靈芝多糖和卡馬西平干預的大鼠皮質和海馬區GLAST、GLT-1、 EAAC1的表達水平較癲癇模型組明顯升高，靈芝多糖組和卡馬西平組之間GLAST、GLT-1、EAAC1三者的表達無統計學意義。同時行為學顯示：癲癇大鼠發作的潛伏期明顯延長，發作時間縮短，說明靈芝多糖可能通過升高GLAST、GLT-1、 EAAC1的表達來降低神經元興奮性，減輕或抑制癲癇發作。

參考文獻：

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[10]SEPKUTY J P, COHEN A S, ECCLES C, et al. A neuronal glutamate transporter contributes to neurotransmitter GABA synthesis and epilepsy[J]. The Journal of Neuroscience : the Official Journal of the Society for Neuroscience, 2002, 22(15): 6372-6379.

[11]GUO Feng, SUN Feng, YU Junling, et al. Abnormal expressions of glutamate transporters and metabotropic glutamate receptor 1 in the spontaneously epileptic rat hippocampus[J]. Brain Research Bulletin, 2010, 81(4/5): 510-516.