玄參水提物對CCL4所致大鼠急性肝損傷的保護作用研究

玄參水提物對CCL4所致大鼠急性肝損傷的保護作用研究

劉冠璋1，董婉茹1，于卉1，高鑫1，李自輝1，劉樹民1,2*

(1.黑龍江中醫藥大學，哈爾濱 150040；2.教育部北藥基礎與應用研究重點實驗室，哈爾濱 150040)

摘要：目的研究玄參水提物對四氯化碳(CCL4)所致大鼠急性肝損傷的保護作用及其作用機制。方法40只SD雄性大鼠隨機分為空白組，CCL4模型組，聯苯雙酯組，玄參水提物高，低劑量組。高、低劑量給藥組大鼠分別給予5.4，1.35 g/kg玄參水提取液灌胃，聯苯雙酯組大鼠給予0.2 g/kg混懸液灌胃,空白組及模型組大鼠給予等體積生理鹽水灌胃，1次/d，連續7 d。末次給藥后1 h,除空白組腹腔注射10 mL/kg橄欖油外，其余各組按10 mL/kg劑量腹腔注射10%CCL4橄欖油溶液。腹腔注射CCL4后，禁食不禁水,24 h后稱重20%烏拉坦麻醉，腹主動脈取血,并迅速摘取肝組織，觀察比較各組大鼠肝組織病理學變化及部分肝功能指標的差異。結果玄參水提物能明顯降低肝損傷大鼠肝臟指數、ALT、AST活性及MDA含量,并且增強SOD和GSH-Px活性，同時對血清中TBiL活性具有一定的降低作用。結論玄參水提物對CCL4所致大鼠急性肝損傷具有明顯的保護作用。

關鍵詞：玄參水提物；四氯化碳；肝損傷；丙二醛；超氧化物歧化酶

DOI:10.13463/j.cnki.jlzyy.2015.05.022

中圖分類號：R575文獻標志碼： A

文章編號：1003-5699(2015)05-0504-04

基金項目:國家重點基礎研究發展計劃“973計劃”(2013CB531804)；黑龍江省高等學校科技創新團隊——研究方向中藥藥性理論研究。

作者簡介:劉冠璋(1990-)，男，碩士研究生，主要從事中藥藥性理論方面的研究。

收稿日期:(責任編輯：張瑞彬2014-12-31)

*通信作者:劉樹民，電話-(0451)82193278，電子信箱-keji-liu@163.com

Laria ningpoensis Hemsl.for CCL4-induced liver injury in rats

LIU Guanzhang1,DONG Wanru1,YU Hui1,GAO Xin1,LI Zihui1,LIU Shumin1,2*

(1.Heilongjiang University of Chinese Medicine,Harbin 150040,China;

2.Key Laboratory of North Medicine Basic and Applied Research,Ministry of Education,Harbin 150040,China)

Abstract:ObjectiveA study on the protective effect and the mechanism of aqueous extract of the Radix Scrophulariae for CCL4-induced liver injury in rats.Methods40 male SD rats were randomly divided into blank group,model group,bifendate pills group,high dose group and low dose group.The high and low dose groups were administered intragastrically with 5.4,1.35 g/kg,bifendate pills group were administered intragastrically with 0.2 g/kg suspension.While rats in the blank

and model groups were given the same volume normal saline,once a day for 7 days.One hour after the last administration,except for the blank group with olive oil solution 10 mL/kg,rats in the other groups were given 10% CCL4olive oil solution 10 mL/kg by intraperitoneal injection.After i.p.administration,forbid food but not water,weighing after 24 h,rats in all groups were anaesthetized with 20% urethane and the blood samples were obtained from abdonminal aorta,and samples of liver tissues were harvested rapidly.Observe and compared the changes of liver tissues pathology and the difference of partial liver function indices.ResultsQueous extract of the Radix Scrophulariae significantly decreased the liver index,the activities of ALT,AST and the content of MDA,increased the activities of SOD,GSH-Px,meanwhile,decreased the activities of TBiL in serum to some extent.ConclusionQueous extract of the Radix Scrophulariae has a significant protection effect on the liver injury induced by CCL4in rats.

Keywords:aqueous extract of the Radix Scrophulariae;carbon tetrachloride;liver injury;malondialdehyde;superoxide dismutase

玄參為玄參科植物玄參(ScrophuLarianingpoensisHemsl.)的干燥根，始載于《神農本草經》[1]，列為中品，味甘、苦、咸，性微寒，歸肺、胃、腎經。我國江南大部均有產出，其中以浙江出產的玄參為道地藥材，稱“浙玄參”。中藥玄參的化學成分主要為環烯醚萜類、苯丙素苷類、芳香糖苷類等[2]。主要功效為涼血滋陰，瀉火解毒。臨床上常用其“清血分、營分之邪熱”治療溫病熱入營血，陰虛內熱等證。另有記載玄參能夠“泄肝陽”“滋肝木……明目”，中醫臨床上常用其養陰解毒的功效治療肝炎[3]。但是現代臨床并未將玄參治療肝臟疾病的作用作為其主要的臨床用途，故而本實驗試圖通過CCL4建立大鼠急性肝損傷模型來初步探討中藥玄參對肝損傷的保護作用及其作用機制。

1實驗材料

1.1儀器GLAMOUR 2000全自動生化分析儀(北京華士信醫療設備有限公司)，AL204電子天平(梅特勒-托利多儀器上海有限公司)，HHS型數顯恒溫水浴鍋(上海博迅實業有限公司醫療設備廠)，UVmini-1240紫外-可見分光光度計(島津國際貿易上海有限公司)，KDC-160HR臺式高速冷凍離心機(科大創新股份有限公司中佳分公司)，LEICA RM2255病理切片機(北京中儀光科科技發展有限公司)，玻璃勻漿器。

1.2藥材與試劑玄參飲片購自黑龍江省藥材公司(批號:20120623012)，經黑龍江中醫藥大學中藥資源與開發教研室王振月教授鑒定為玄參科植物玄參(ScrophularianingpoensisHemsl.)的干燥根。聯苯雙酯由浙江萬邦藥業股份有限公司生產(產品批號：20140204)。橄欖油購于哈爾濱海浪科技有限公司。考馬斯亮藍蛋白、超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)及谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)試劑盒均購自南京市建成生物工程研究所。實驗中所用其他試劑均為國產分析純。

1.3實驗動物SD大鼠40只，SPF級，雄性，體質量(240±20) g，由黑龍江中醫藥大學動物實驗中心提供，許可證號：SCXK(黑)2013-004。適應性喂養3 d后進行實驗，所有實驗大鼠的使用和喂養嚴格遵照動物保護協會所規定的有關條款。

2實驗方法

2.1藥物的制備玄參干燥根經適量粉碎后，等量分為6份，每份600 g。一煎10倍量水，二煎8倍量水，分別加熱回流提取各1.5 h，合并兩煎藥液，于低溫干燥機中凍干，得到6批質地如羽毛狀輕軟、棕黃色的玄參凍干粉末(出膏率：49.76%)。

2.2實驗分組及處置實驗動物適應性喂養3 d后隨機分為5組，每組8只，即:空白組，CCL4模型組，聯苯雙酯組，玄參水提物高、低劑量組。各組均在每日9：00-10：00按照10 mL/kg(體質量)灌胃給予相應的試劑，連續7 d，1次/d。其中玄參水提物高、低劑量給藥組大鼠分別給予5.4,1.35 g/kg玄參水提取液，聯苯雙酯組大鼠給予0.2 g/kg混懸液，空白組及CCL4模型組大鼠給予等體積生理鹽水。于末次給藥1 h后,除空白組腹腔注射10 mL/kg橄欖油外，其余各組按10 mL/kg劑量腹腔注射10%CCL4橄欖油溶液。腹腔注射CCL4后,各組均禁食不禁水，24 h后稱重,20%烏拉坦麻醉，由腹主動脈取血，并迅速摘取肝組織留存備檢。

2.3血清及肝臟生化指標的測定取血后，室溫靜置20 min，4 ℃，4 000 r/min離心10 min取上清液，于-80 ℃低溫保存用于ALT，AST，TBiL生化指標測定。用冷生理鹽水盡可能去除肝臟殘留的血，濾紙吸干后稱重，計算肝臟指數。肝臟指數=肝質量/體質量×100%。同一肝小葉上取1.00 g肝組織加9倍量冷生理鹽水于冰水浴上手動勻漿制備10%肝組織勻漿,4 ℃,3 500 r/min離心10 min取上清用于肝組織中MDA，SOD，GSH-PX的測定，具體操作按試劑盒說明書進行。剩余肝臟10%甲醛固定,送黑龍江中醫藥大學附屬第一醫院病理科做組織切片，進行HE染色，在光鏡下觀察肝組織病理學變化。

3實驗結果

3.1玄參水提物對急性肝損傷大鼠肝臟指數的影響與空白組比較，CCL4模型組肝臟指數顯著性升高(P<0.01)，說明CCL4可引起肝組織明顯腫大；與CCL4模型組比較,玄參水提物高、低劑量組肝臟指數均顯著性降低(P<0.01或P<0.05)；與聯苯雙酯組比較，玄參水提物高劑量組肝臟指數差異無統計學意義，低劑量組肝臟指數雖有降低趨勢，但差異有統計學意義(P<0.01)。結果表明,玄參水提物對CCL4所致大鼠急性肝損傷肝臟指數具有改善作用，且高劑量組更為明顯。結果見表1。

組別劑量/(g/kg)肝臟指數/%空白組 —3.04±0.10 CCL4模型組 —4.46±0.41▲▲ 聯苯雙酯組 0.23.40±0.20## 玄參水提物低劑量組1.353.99±0.32#△△玄參水提物高劑量組5.43.54±0.22##

注：與CCL4模型組比較，#P<0.05，##P<0.01;與聯苯雙酯組比較，△△P<0.01；與空白組比較，▲▲P<0.01

3.2玄參水提物對急性肝損傷大鼠血清ALT、AST及TBiL活性的影響與空白組比較,CCL4模型組大鼠血清中ALT、AST及TBiL顯著性升高(P<0.01)，說明CCL4造模成功；與CCL4模型組比較，玄參水提物高、低劑量組大鼠血清中ALT、 AST均顯著性降低(P<0.01)，玄參水提物高、低劑量組大鼠血清中TBiL雖有降低趨勢，但差異無統計學意義(P>0.05)；與聯苯雙酯組比較，玄參水提物高劑量組大鼠血清中ALT、AST差異無統計學意義,低劑量組大鼠血清中ALT、AST差異具有統計學意義(P<0.05)，但仍有降低趨勢，各組大鼠血清中TBiL均無顯著性差異。結果表明，玄參水提物對急性肝損傷大鼠血清中ALT、AST具有降低作用，且高劑量組效果更好。結果見表2。

表2　玄參水提物對CCL 4 所致大鼠急性肝損傷血清ALT、AST、TBiL的影響

注：與空白組比較，##P<0.01；與CCL4模型組比較，△P<0.05，△△P<0.01；與聯苯雙酯組比較，▲P<0.05

3.3玄參水提物對急性肝損傷大鼠肝臟SOD、GSH-Px活力和MDA含量的影響與空白組比較，CCL4模型組大鼠肝臟中SOD活性顯著性降低(P<0.01)，MDA含量顯著性升高(P<0.01)，GSH-Px活性明顯降低(P<0.05)；與CCL4模型組比較，玄參水提物高劑量組SOD活性顯著性升高，MDA含量顯著性降低(P<0.01)，玄參水提物低劑量組SOD活性顯著性升高(P<0.01),GSH-Px活性明顯升高(P<0.05)；與聯苯雙酯組比較，玄參水提物高劑量組大鼠肝臟中SOD、GSH-Px活性及MDA含量差異均無統計學意義,低劑量組大鼠肝臟中SOD、GSH-Px活性差異無統計學意義,MDA含量降低趨勢不明顯(P<0.05)。結果表明,玄參水提物對急性肝損傷大鼠肝臟中SOD、GSH-Px活性及MDA含量具有改善作用。結果見表3。

表3　玄參水提物對CCL 4所致大鼠急性肝損傷肝臟中SOD、GSH-Px活性及MDA含量的影響

注：與空白組比較，#P<0.05，##P<0.01；與CCL4模型組比較，△P<0.05，△△P<0.01；與聯苯雙酯組比較，▲P<0.05

3.4大鼠肝組織病理學研究

3.4.1肉眼觀察空白組大鼠肝臟顯紅褐色，質軟而脆，邊緣圓頓,各肝小葉間無黏連。CCL4模型組大鼠肝臟有呈暗紅色或有呈黃褐色，質地較韌，體積較大，表面附有蒼白色黏膜，與周圍臟器黏連較嚴重，并伴有點狀壞死區域。玄參水提物低劑量組肝臟顏色偏暗，輕微質韌，存在斑點斑塊。聯苯雙酯組和玄參水提物高劑量組肝臟形態介于空白組和玄參水提物低劑量組之間。

3.4.2光鏡觀察與空白組比較,CCL4模型組大鼠肝細胞大面積的空泡性壞死，小葉間動靜脈充血，肝小葉結構嚴重被破壞，匯管區及小葉內炎性細胞浸潤。聯苯雙酯組肝細胞中度的空泡性壞死，竇狀隙內有較多的紅細胞，血管周圍少量炎性細胞浸潤，對CCL4所致大鼠急性肝損傷幾乎無保護作用。玄參水提物低劑量組情況皆差于聯苯雙酯組。玄參水提物高劑量組肝細胞發生輕度空泡性變形紅染，中央靜脈周圍充血減輕，肝小葉結構清楚，血管周圍少量炎性細胞浸潤，肝組織病變明顯減輕。表明玄參水提物對CCL4所致大鼠急性肝損傷具有一定的保護作用，且高劑量組效果更好。

4結論

肝損傷是多因素參與的復雜過程，如改變質膜的完整性、細胞內離子濃度變化、自由基的作用、免疫變態反應等都可引起肝損傷[4]。

動物的肝臟指數與肝損傷呈正相關關系,是反映肝臟受損程度的客觀指標[5]。血清中ALT和AST含量在一定程度上反映了肝細胞受損程度，是反映肝損傷的敏感且最常用的指標[6]。當肝臟受損時，由于肝臟處理及排泄間接膽紅素功能障礙，致使血液中的TBiL含量升高[7]。MDA是重要的脂質過氧化產物，MDA的含量可反映組織過氧化損傷程度，間接反映細胞的損傷情況[8]。SOD為高效的清道夫,可抑制自由基啟動的脂質過氧化，GSH-Px特異地催化還原性GSH對過氧化氫的還原反應，起到保護細胞膜結構與功能完整的作用[9]。SOD與GSH-Px不僅在活性上能協同作用，還能組成相互保護的防御群，更有效的清除機體內自由基，保護細胞免遭氧化損傷，維持體內代謝平衡[10]。

現代研究發現，玄參的氯仿粗提物極其所含的單體化合物，對硫代乙酰胺誘導的大鼠肝損傷均有較好的保護作用[11]。玄參中苯丙素苷對于受損肝細胞能明顯提高其存活率，降低肝衰竭大鼠的AST、ALT水平，對肝細胞損傷有較好的保護作用[12]。本實驗進一步驗證了傳統意義上玄參水煎煮液對CCL4所致大鼠急性肝損傷的保護作用。結果表明，玄參水提物對CCL4所致大鼠急性肝損傷具有明顯的保護作用,能顯著降低肝損傷大鼠肝臟指數、ALT、AST活性及MDA含量，并且增強SOD和GSH-PX活性，同時對血清中TBiL活性具有一定的降低作用，其機制可能與阻止肝臟抗氧化酶活性降低，提高肝細胞清除自由基能力及抗脂質過氧化作用相關，但其保肝活性成分及更深入的作用機制還有待進一步研究。

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