四逆散及其拆方對實驗性潰瘍性結腸炎大鼠SOCS1·STAT6活性的影響

四逆散及其拆方對實驗性潰瘍性結腸炎大鼠SOCS1·STAT6活性的影響

趙令竹,曲道煒,林庶茹,盧健*,張宏邈

(遼寧中醫藥大學，沈陽 110847)

摘要：目的從IL-4/STAT6信號通路入手，以該通路負反饋調節因子SOCS1和關鍵因子STAT6為檢測指標，多角度探查潰瘍性結腸炎的發生與IL-4的關系。方法將實驗動物分為6組,采用免疫法造模，用免疫組化法檢測大鼠SOCS1、STAT6的活性。結果模型組實驗大鼠SOCS1活性(0.485 5±0.178 0)顯著低于正常組(0.655 2±0.187 4)，P<0.05；而STAT6 活性(0.803 0±0.208 2)則明顯高于正常組(0.589 3±0.191 9)，P<0.05。四逆散能顯著增加實驗大鼠SOCS1活性(0.576 5±0.208 0)(P<0.05),降低STAT6活性(0.579 8±0.152 6)(P<0.05)；柴芍配伍(0.562 5±0.275 7)對SOCS1活性的影響與四逆散(0.576 5±0.208 0)比較差異無統計學意義，對STAT6活性(0.529 4±0.144 3)表達的影響顯著優于四逆散(0.579 8±0.152 6)(P<0.05);芍枳甘配伍(0.616 9±0.200 6)對STAT6活性的影響作用明顯,與四逆散(0.579 8±0.152 6)比較差異無統計學意義；柴枳甘配伍對SOCS1(0.509 1±0.227 9)、STAT6(0.756 1±0.263 6)的影響與模型組(0.485 5±0.178 0；0.803 0±0.208 2)比較差異無統計學意義。結論四逆散能夠通過刺激SOCS1活性,抑制STAT6活性表達來調節IL-4/STAT6通路，進而干預實驗性潰瘍性結腸炎。其中，柴芍配伍作用明顯;芍枳甘配伍對STAT6活性的影響作用明顯，但對SOCS1的影響不顯著；柴枳甘配伍對SOCS1、STAT6的影響均不顯著。

關鍵詞：四逆散；SOCS1；STAT6；潰瘍性結腸炎；大鼠

DOI:10.13463/j.cnki.jlzyy.2015.10.026

中圖分類號：R285.5文獻標志碼： A

文章編號：1003-5699(2015)10-1056-04

基金項目:教育部高等學校博士學科點專項科研基金新教師類資助課題(20122133120009)。

作者簡介:趙令竹(1975-)，女，博士研究生，講師，主要從事《傷寒論》經典方劑的現代研究與應用。

收稿日期:(責任編輯：趙玉芝2015-01-06)

*通信作者:盧健,電話-15242007553,電子信箱-juioo@sina.com

Sini powders and different compatibilities influence on SOCS1·STAT6 in

experimental ulcerative colitis rats

ZHAO Lingzhu,QU Daowei,LIN Shuru,LU Jian*,ZHANG Hongmiao

(Liaoning University of Traditional Chinese Medicine,Shenyang 110847,China)

Abstract:ObjectiveTo explore the relation with IL-4 and UC through multi angles,starting with the IL-4/STAT6 pathway.MethodsThe experimental animals were divided into 6 groups.We made the model in immune method,detected activity of SOCS1 and STAT6 in rats with immune.ResultsThe activity SOCS1 in model group of rats (0.485 5±0.178 0) were significantly lower than that of normal group (0.655 2±0.187 4)(P<0.05),but the activity of STAT6(0.803 0±0.208 2) were significantly higher than that in the normal group (0.589 3±0.191 9) (P<0.05).Sinisan Powders can significantly increase the activity of SOCS1 (0.576 5±0.208 0) in experimental rats (P<0.05),decrease STAT6 activity (0.579 8±0.152 6) (P<0.05).The effects of Chaishao compatibility (0.562 5±0.275 7) was no significant difference with SOCS1 and Sinisan (0.576 5±0.208 0) Powders (P>0.05),the activity of STAT6 (0.529 4±0.144 3) was significantly better than the Sinisan (0.579 8±0.152 6) Powders (P<0.05).Shaozhigan compatibility effects on activity of STAT6 (0.616 9±0.200 6) significantly.Chaizhigan compatibility had no significant difference with SOCS1 (0.509 1±0.227 9),STAT6(0.756 1±0.263 6) and the model group (0.485 5±0.178 0;0.803 0±0.208 2) in effects (P>0.05).ConclusionSinisan Powders can regulate expression of the IL-4/STAT6 pathway by stimulating the activity of SOCS1,inhibiting the activity of STAT6,then intervention experiment UC.And the effect of Chaishao compatibility was the best obvious;the effects of Shaozhigan compatibility was obvious on activity of STAT6,but not on SOCS1.The effect of Chaizhigan compatibility were not obvious on SOCS1 and STAT6.

Keywords:Sini powers;SOCS1;STAT6;ulcerative colitis;rat

潰瘍性結腸炎(ulcerative colitis，UC)為臨床常見病、難治病。大量臨床研究與實驗研究表明，潰瘍性結腸炎的發病與細胞因子密切相關。有研究表明，IL-4作為抗炎因子,參與了潰瘍性結腸炎的炎癥過程。本課題組成員，在前期工作中已通過實驗證實潰瘍性結腸炎大鼠的炎癥反應與IL-4相關，其可以通過NF-κB相關通路加以調控[1-2]。為進一步探討潰瘍性結腸炎與IL-4的關系，本研究從IL-4/STAT6信號通路入手，以該通路負反饋調節因子SOCS1和關鍵因子STAT6為檢測指標,多角度探查潰瘍性結腸炎的發生與IL-4的關系，為研究中藥多途徑發揮作用提供思路。

1實驗材料

四逆散由柴胡、芍藥、枳實、甘草以1∶1∶1∶1比例組成。柴胡免煎顆粒(1312079)、芍藥免煎顆粒(1312028)、枳實免煎顆粒(1312168)、甘草免煎顆粒(1312100)均購自江蘇省江陰天江藥業有限公司；固腸止瀉丸購自沈陽市東北大藥房，批號：132440，由西安阿房宮藥業有限公司提供。上述藥物按臨床成人用量的6.3倍折算實驗大鼠的用量。SD大鼠(SPF級，SCXK(遼)2010-0001)60只,雌雄各半，體質量160～180 g，由上海西普爾-必凱實驗動物有限公司提供。根據前期實驗結果，將實驗大鼠按體質量隨機分為6組，分別為:正常組、模型組、四逆散組、柴枳甘組、芍枳甘組、柴芍組。每組10只，各組體質量統計學比較無顯著差異。抗體(BA1110)、DAB顯色試劑盒(AR1322),均購自武漢博士德生物工程有限公司。ASP300脫水機，德國徠卡儀器有限公司；SAKURA包埋機，日本櫻花會社;Leica(H11210)烤片機，德國徠卡儀器有限公司；DH-GZX電熱恒溫干燥箱，中國廈門醫療電子儀器廠；濕盒(ZLI-9322),北京中杉金橋生物技術有限公司；OLYMPUS顯微鏡(BX-51)，TKO光學儀器株式會社(日本)。

2實驗方法

2.1免疫法造模[3]應用新鮮家兔結腸黏膜配制抗原乳化液,按1 mL/100 g體質量的濃度分別配制灌胃藥物。于造模第1天分別于實驗大鼠雙側足跖、腹股溝及背部注射抗原乳化液約0.5 mL/只；第7、14、21天依同法注射；造模第2天開始分組灌胃。每天觀察大鼠狀態及飲食、飲水情況；每周測1次體質量。實驗第24天灌胃后2 h，稱重，麻醉，腹主動脈取血；然后全部處死，自肛門2 cm上約8 cm處剖取結腸，剖開、展平結腸，觀察黏膜，并以多聚甲醛固定，做病理切片，鏡下觀察。

2.2結腸組織病理切片常規HE染色，光鏡下觀察。

2.3大鼠結腸黏膜SOCS1、STAT6免疫組化的測定采用免疫組化法(SP)，按常規步驟進行。SOCS1、STAT6陽性細胞染色均定位于細胞質，以胞質中呈棕黃或更深的棕褐色的細小顆粒為陽性細胞。應用Image-Pro Plus 6.0專業圖像分析軟件對實驗結果進行分析，以平均光密度反應SOCS1、STAT6細胞活性。

3實驗結果

3.1對實驗性潰瘍性結腸炎大鼠一般狀況的影響造模第l4天，實驗大鼠出現食量減少、拱背、聚堆、懶動現象。造模第22天，模型組大鼠均出現飲食明顯減少，稀便、毛發不澤，拱背、聚堆、懶動，各藥物組大鼠上述癥狀有不同程度改善。

3.2結腸組織病理學模型組大鼠病變結腸黏膜表面可見潰瘍，個別深達肌層，炎癥反應較重，有充血、糜爛，中性粒細胞浸潤，黏膜上皮部分缺失，局部固有層腺體減少，黏膜下層血管增生，黏膜肌層不明顯(圖1)。其余各組均有不同程度的病變。

圖1　實驗大鼠結腸組織病理切片(Colon HE×100)

3.3對實驗大鼠SOCS1、STAT6蛋白活性的影響

3.3.1對實驗性潰瘍性結腸炎大鼠SOCS1蛋白活性的影響(圖2)與正常組比較,模型組及各給藥組實驗大鼠SOCS1活性明顯降低(P<0.05)；與模型組比較，四逆散組和柴芍組各實驗大鼠SOCS1活性均明顯升高(P<0.05)；與四逆散組比較，柴芍組無顯著性差異(P>0.05)，柴枳甘組與芍枳甘組實驗大鼠SOCS1活性明顯均顯著降低(P<0.05)。見表1。

圖2　實驗大鼠結腸組織SOCS1免疫組化圖片(Colon HE×40)

3.3.2對實驗性潰瘍性結腸炎大鼠STAT6蛋白活性的影響(圖3)與正常組比較，模型組實驗大鼠STAT6活性明顯增高(P<0.05)；與模型組比較，四逆散組、芍枳甘組與柴芍組實驗大鼠STAT6活性顯著降低(P<0.05)；與四逆散組比較，芍枳甘組實驗大鼠STAT6活性無顯著性差異(P>0.05)，柴枳甘組明顯增高(P<0.05),而柴芍組則顯著降低(P<0.05)。見表1。

圖3　實驗大鼠結腸組織STAT6免疫組化圖片(Colon HE×40)

組 別結腸組織SOCS1平均光密度結腸組織STAT6平均光密度正常組 0.6552±0.1874 0.5893±0.1919 模型組 0.4855±0.1780# 0.8030±0.2082# 四逆散組0.5765±0.2080#△0.5798±0.1526△ 柴枳甘組0.5091±0.2279#▲0.7561±0.2636#▲ 芍枳甘組0.4824±0.1387#▲0.6169±0.2006△ 柴芍組 0.5625±0.2757#△0.5294±0.1443#△▲

注：與正常組比較,#P<0.05；與模型組比較,△P<0.05；與四逆散組比較,▲P<0.05

4討論

潰瘍性結腸炎是一種病因不明的慢性非特異性腸道炎癥，中醫認為潰瘍性結腸炎總屬本虛標實之證，本虛以脾腎虧虛，陰陽氣血虧虛為主，標實以濕熱毒邪蘊結，氣血阻滯，兼有肝郁，肺氣失宣等[4],辨證治療潰瘍性結腸炎具有明顯的優勢及鮮明的特色[5]，如以柴胡芍藥湯為主方辨證治療潰瘍性結腸炎，療效顯著[6]。中醫中藥通過何種途徑、如何發揮療效也成為晚近研究的熱點。

大量研究表明[7-10],潰瘍性結腸炎的炎癥反應與IL-4密切相關。IL-4主要通過信號轉導子和轉錄激活子(signal transducers and activator of transcription,STAT)信號轉導以及表達細胞信號抑制因子(suppressor of cytokine signaling，SOCS)對Th細胞的分化進行調節。

IL-4的信號轉導主要與JAK/STAT途徑有關。JAK-STAT細胞信號傳遞途徑是近幾年新發現的從分子水平調控細胞因子生物學功能的重要途徑之一。一種細胞因子的信號通路可以激活多個JAK激酶，但對激活的STAT分子卻具有一定的選擇性，IL-4能選擇性地激活STAT6,促炎反應的發生可能是IL-4/STAT6信號轉導失調所致[11]。IL-4通過SOCSI蛋白調節細胞因子信號的產生和衰減[12]。IL-4/STAT6的信號可使Th2表達SOCS1，而SOCS1的過表達則主要抑制IL-4所誘導的STAT6[13]。SOCS是細胞因子激活的JAK/STAT信號通路必需的負調節因子，對于啟動炎癥反應非常重要[14]。STAT是最能代表JAK底物的底物之一[15]，在信號轉導和轉錄激活上發揮關鍵性作用。STAT6作為轉錄因子調節IL-4的反應[16]，在炎癥、自身免疫和變態反應性疾病中起重要作用,近年的研究發現，潰瘍性結腸炎大鼠結腸組織STAT6水平升高[17]。

由表1可以看出，模型組實驗大鼠SOCS1 活性顯著低于正常組(P<0.05),而STAT6活性則明顯高于正常組(P<0.05)。灌服四逆散后，實驗大鼠SOCS1活性顯著增加(P<0.05)，而STAT6活性則顯著降低(P<0.05)，說明四逆散能夠通過刺激SOCS1活性,抑制STAT6活性表達來調節IL-4/STAT6通路，進而干預實驗性潰瘍性結腸炎。

從3個拆方組可以看出，柴芍配伍對SOCS1活性的影響與四逆散無顯著性差異(P>0.05)，但對STAT6活性表達的影響顯著優于四逆散(P<0.05)；芍枳甘配伍對STAT6活性的影響作用明顯，與四逆散比較無顯著性差異(P>0.05)，但對SOCS1的影響不明顯；柴枳甘配伍對SOCS1、STAT6的影響均不顯著，與模型組無顯著性差異(P>0.05)。

綜上分析，四逆散能夠通過調節SOCS1、STAT6 活性的表達來影響IL-4/STAT6通路，干預實驗性潰瘍性結腸炎。方中柴芍配伍作用明顯；四逆散去除柴胡后,對STAT6活性的影響作用明顯；而四逆散去除白芍后，對SOCS1、STAT6的影響均不明顯。

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