補骨脂素對胃癌細胞株BGC-803增殖和凋亡的影響及其機制

補骨脂素對胃癌細胞株BGC-803增殖和凋亡的影響及其機制

閆偉偉1,3,章永紅1,劉軍樓1*,吳堅2,鄒璽2,劉沈林2,楊繼兵1,于希忠1

(1.南京中醫藥大學,南京 210023;2.南京中醫藥大學第一附屬醫院,南京210029;

3.南陽市第一人民醫院,南陽 473010)

摘要：目的研究補骨脂素對人胃癌BGC-803細胞的增殖和凋亡的影響并探討其機制。方法以不同濃度的補骨脂素作用于體外培養的胃癌細胞BGC-803，不同時間后，采用MTT法檢測藥物對腫瘤細胞生長抑制率，流式細胞儀檢測細胞凋亡率,激光共聚焦顯微鏡觀察F-actin形態學變化。結果補骨脂素對人胃癌細胞株BGC-803具有明顯的生長抑制作用，并與藥物劑量及處理時間成正相關。補骨脂素作用于細胞24、48、72 h后的IC50分別為92.6、25.54、7.68 μg/mL。流式細胞儀檢測結果顯示給藥組早期凋亡的百分率顯著高于對照組，細胞骨架蛋白F-actin呈現解聚狀態。結論：補骨脂素可抑制胃癌BGC-803細胞增殖，誘導腫瘤細胞凋亡，其機制可能是藥物引起了細胞骨架蛋白F-actin解聚。

關鍵詞：補骨脂素；胃癌；抑制增殖；細胞凋亡；細胞骨架蛋白

DOI:10.13463/j.cnki.jlzyy.2015.10.028

中圖分類號：R285.5文獻標志碼： A

文章編號：1003-5699(2015)10-1064-04

基金項目:江蘇高校優勢學科建設工程(中西醫結合)資助項目(PAPD)；江蘇省中醫藥局課題資助項目(JD11038)。

作者簡介:閆偉偉(1988-)，男，2012級碩士研究生，主要從事中醫腫瘤病學研究。

收稿日期:(責任編輯：趙玉芝2015-03-30)

*通信作者:劉軍樓，電話-13585148565，電子信箱-liujunlou1975@126.com

Psoralen on proliferation and apoptosis of gastric cancer cell line BGC-803 and its mechanism

YAN Weiwei1,3,ZHANG Yonghong1,LIU Junlou1,WU Jian2,ZOU Xi2,LIU Shenlin2,YANG Jibing1,YU Xizhong1

(1.Nanjing University of Chinese Medicine,Nanjing 210023,China;

2.The First Hospital Affiliated to Nanjing University of Chinese Medicine,Nanjing 210029,China;

3.The First People's Hospital of Nanyang,Nanyang 473010,Henan Province,China)

Abstract:ObjectiveThis experiment aims at observing the inhibition effects of Psoralen and apoptosis on human gastric carcinoma BGC-803 cells,discusses the possible mechanisms.MethodsBGC-803 cells in culture medium were treated with different concentrations of Psoralen.After different time period,the inhibitory rate of the cells was measured by MTT assay.Cell apoptotic rate was detected by flow cytometry (FCM).The morphological changes of F-actin were observed by laser confocal microscopy.ResultsThe growth of human gastric carcinoma BGC-803 cells was significantly inhibited by Psoralen,as the concentration increasing and the work time extending,the inhibition grows,which could be concluded as time-dose dependence.IC50 of Psoralen was respectively 92.6,25.54,7.68 μg/mL after 24 hours,48 hours,72 hours.The early apoptotic rate of BGC-803 cells was significantly higher than the control group’s.F-actin cytoskeletal protein was showed from polymerization to depolymerization after Psoralen treatment.ConclusionPsoralen can obviously inhibit the proliferation and induce apoptosis of BGC-803 cells.The mechanisms may involve the depolymerization of F-actin after treatment with Psoralen.

Keywords:psoralen;gastric carcinoma;antiproliferation;apoptosis;cytoskeletal protein

胃癌是嚴重威脅人類健康的重大疾病之一，發病率及死亡率逐年增加，對社會及家庭帶來了沉重的壓力及負擔[1-5]。中醫藥治療惡性腫瘤毒副作用低且療效顯著，對防治胃癌有較大的潛力與優勢。中藥補骨脂為豆科植物，性辛、苦、溫，入腎、脾經，具有補腎壯陽，納氣平喘，暖脾止瀉等作用，主要用于治療腎虛陽痿、腰膝冷痛、脾腎陽虛之五更泄瀉等。現代研究發現,補骨脂主要提取物之一補骨脂素(Psoralen)對JB6皮膚癌細胞株、膀胱癌細胞株、肝癌細胞株、人乳腺癌細胞株等多種腫瘤細胞均有明顯的生長抑制作用[6-7]。鮮見文獻報道補骨脂素對胃癌細胞有抑制作用，但對其作用機制尚無文獻報道，也未見補骨脂素作用于細胞骨架蛋白的研究報道。本文研究補骨脂素對人胃癌BGC-803細胞的增殖、凋亡及細胞骨架蛋白F-actin的影響，探究其可能機制，為其進一步應用于臨床治療胃癌提供有力的實驗依據。

1材料和方法

1.1實驗藥物及細胞株補骨脂素購自澤朗醫藥科技有限公司(純度≥98%)；人胃癌BGC-803細胞株由江蘇省中醫院腫瘤內科實驗中心惠贈。BGC-803細胞用含10%小牛血清的DMEM培養基培養于25 mL塑料培養瓶中，37 ℃，體積分數為5%CO2培養箱常規培養。補骨脂素用DMSO溶解后加入三蒸水，配制成含10% DMSO濃度為100 mmol/L的母液，-4 ℃保存，應用時加培養基稀釋成目標濃度(DMSO的終濃度≤0.01%，無明顯細胞毒作用)。

1.2實驗試劑小牛血清(杭州四季青)；DMEM高糖培養基(賽默飛世爾);胰蛋白酶+EDTA、MTT試劑盒(凱基生物)；Annexin V-FITC細胞凋亡檢測試劑盒(BD)；DMSO(Sigma)：CytoPainter Phalloidin-iFluor 594 Reagent (Abcam)。

1.3主要儀器設備MCO-20A IC二氧化碳培養箱(SANYO)，超凈工作臺，MDF-382超低溫冰箱(SANYO)，IX50型倒置顯微鏡(Olympus)，Biophometer分光光度計(EPPENDORF)，5417型低溫高速離心機(EPPENDORF)，FACScan型流式細胞儀(Becton Dickinson)，激光共聚焦顯微鏡(Leica)等。

1.4實驗方法

1.4.1細胞增殖抑制率的測定(MTT法)采用噻唑藍(MTT)還原法進行檢測：取對數生長期BGC-803細胞，用培養基將細胞稀釋至最終濃度為0.4×105/mL,然后混合均勻以每孔100 μL接種于無菌的96孔培養板中，繼續培養12 h后待細胞完全貼壁，移除上清液，分別加入含100、50、25、12.5、6.25 μg/mL補骨脂素的DMEM培養基100 μL，每種濃度均設6個平行孔；對照組加入不含藥物的DMEM培養基100 μL。繼續將培養板置于孵箱中分別培養至24、48、72 h后，于終止培養前4 h，分別向各孔均加入5 mg/mL MTT溶液20 μL，然后放至孵箱內繼續培養4 h后棄上清液，各孔加入DMS0 150 μL后將培養板避光置于振蕩器上振蕩5～10 min溶解藍色結晶,以酶標儀于550 nm處讀取各孔吸光度值(A550)，計算細胞生長抑制率與IC50。細胞生長抑制率(%)=[對照組A值—實驗組A值]/對照組A值×100%。實驗重復3次。

1.4.2流式細胞儀檢測細胞凋亡取對數生長期細胞，調整細胞濃度為1×105/mL，然后混合均勻，按每孔2 mL接種于無菌的六孔板中。培養12 h后待細胞完全貼壁后移除上清液，分別加入含50、30、25、20 μg/mL補骨脂素的DMEM培養基2 mL，空白對照組加入不含藥物的DMEM培養基繼續培養。藥物處理細胞48 h終止培養，棄上清液，加入含EDTE的胰酶0.5 mL消化3 min后，加入含小牛血清的DMEM培養液終止消化，并用移液器將細胞移至10 mL離心管內，以1 000 r/min，5 min離心后移除上清液，向試管內加入500 μL Binding Buffer輕輕吹打，使細胞重懸均勻，然后加入5 μL PI試劑和5 μL Annexin V-FITC試劑，混勻后避光孵育15 min，然后用流式細胞儀檢測。

1.4.3免疫熒光顯微鏡下觀察補骨脂素對BGC -803細胞骨架結構的影響具體操作步驟為：1)細胞爬片：將蓋玻片清洗后高溫滅菌，烘干后平放到六孔板內，將BGC-803細胞用含10%小牛血清的DMEM培養液在37 ℃、5%CO2培養箱中培養,待細胞生長良好進入對數期后收集細胞，用DMEM培養液將細胞稀釋，利用細胞計數板在顯微鏡下計數，直到細胞濃度為1×105/mL，然后混合均勻,按每孔2 mL接種于無菌的六孔板中。培養12 h后待細胞完全貼壁，移除上清液，PBS清洗3次后分別加入含50、30、25、20 μg/mL補骨脂素的DMEM培養基2 mL,空白對照組加入不含藥物的DMEM培養基繼續培養。2)細胞固定：藥物處理細胞48 h后停止培養,用PBS漂洗3次，然后向蓋玻片上滴加4%的多聚甲醛200 μL，將六孔板放至冰上固定30 min后，用PBS漂洗3次，然后用棉簽吸除蓋玻片周圍的水份，加入0.1% Triton 100 μL，以覆蓋蓋玻片為度，靜置5 min后用PBS再漂洗3次。3)染色：加入100 μL 1×Phalloidin工作液室溫放置90 min，常溫下PBS漂洗3次后于熒光顯微鏡上觀察并攝影。

2結果

2.1補骨脂素對BGC-803細胞的生長抑制作用不同濃度的補骨脂素(6.25～100 μg/mL)分別作用于BGC-803細胞24、48、72 h，與對照組比較，結果顯示:補骨脂素對人胃癌細胞株BGC-803的增殖有明顯的抑制作用，并有時間及濃度的依賴性。隨著藥物濃度的遞增及處理時間的增加，其對細胞的抑制率也顯著上升(P<0.01)；在處理時間相同的情況下,當藥物濃度達到100 μg/mL時，對BGC-803細胞的抑制作用達到最強。結果見表1,根據公式分別計算出補骨脂素作用人胃癌細胞株BGC-803 24、48、72 h后各自IC50值，結果見表2。

表1　補骨脂素對人胃癌細胞株BGC-803的抑制率 ± s)

注：和對照組相比，#P<0.05,##P<0.01

表2　不同時間補骨脂素作用于人胃癌細胞株BGC-803的IC 50值μg/mL

2.2流式細胞儀檢測補骨脂素對人胃癌BGC-803細胞的凋亡比率以50、30、25、20 μg/mL的補骨脂素作用于BGC-803細胞48 h后，用流式細胞儀檢測細胞凋亡情況，藥物濃度為20 μg/mL時，早期凋亡率達到8.34%；并且隨著藥物濃度的增加，早期凋亡率由8.34%，分別增加至9.47%、28.13%和60.16%。與空白對照組3.11%相比，均有統計學意義(P<0.01)。

2.3激光共聚焦顯微鏡觀察細胞骨架蛋白F-actin的形態學變化細胞經藥物處理48 h后可見：同等培養條件下，鬼筆環肽(phalloidin)能和細胞的纖維肌動蛋白F-actin特異性的結合，由FITC-phalloidin標記的細胞F-actin呈橘紅色熒光，空白對照組細胞生長狀態良好，周圍生有多個偽足，細胞大致呈梭形或者多邊形生長，細胞內骨架清晰完整，染色均勻，呈網狀分布，緊密地排列在細胞核周圍及細胞膜內側，并可見細胞內大量骨架蛋白從細胞膜一側貫穿至另一側，與細胞質緊密相連,排列整齊有序。而分別經濃度為25、30、50 μg/mL補骨脂素處理后的細胞，鏡下可見細胞周圍偽足數目明顯減少，呈蜷縮狀態。細胞內骨架蛋白排列紊亂，熒光染色較淺，表明骨架蛋白數量較少，排列雜亂無章，并且細胞質之間無相連骨架蛋白，且細胞骨架蛋白排列隨著藥物濃度的增加越來越紊亂，數量也越來越少，與未加藥物組相比，明顯出現了細胞骨架的解聚。

3討論

目前胃癌的治療主要以手術及放化療為主，手術是胃癌根治的主要途徑，但是關于術后的復發轉移、病人體質的恢復及放化療后的毒副反應的耐受程度，西醫對癥處理療效仍不理想。近些年關于中醫藥抗腫瘤的研究取得了巨大的進展，并且在中醫藥的復方及單味藥的研究方面取得了豐富的經驗。

本實驗以胃癌細胞株BGC-803為研究對象，應用多種方法觀察補骨脂素對腫瘤細胞的影響。結果顯示，補骨脂素能夠抑制胃癌細胞的增殖并且藥物劑量和作用時間呈正相關；進一步觀察補骨脂素對胃癌細胞凋亡的影響，發現給藥組早期凋亡的百分率顯著高于對照組，證實其能夠誘導細胞的凋亡，說明其抑制腫瘤細胞增殖作用可能與誘導腫瘤細胞凋亡有關。

細胞骨架是細胞內蛋白質成分組成的網絡結構，包括微管、微絲和中間纖維。微絲是3種骨架結構中最細的，主要由actin組成，以游離球狀actin(G-actin)或聚合纖維狀actin(F-actin)形式存在。RAO J等[8]研究表明，actin聚合/解聚狀態的改變，即actin骨架重組，對惡性腫瘤細胞的形態和表型有非常重要的調節作用,認為干預細胞骨架微絲actin重組可作為抗癌藥物的作用靶點，也可作為研發新的抗腫瘤藥物的依據。本實驗通過F-actin抗體免疫熒光染色法觀察Psoralen對腫瘤細胞骨架蛋白影響，研究結果提示藥物干預后引起了F-actin聚合/解聚狀態的改變，主要可能是藥物引起了F-actin解聚,導致F-actin相對減少而G-actin相對增加，從而呈現細胞內骨架蛋白排列紊亂，細胞質熒光染色減弱。

大量的研究證明，補骨脂素對多種腫瘤細胞的生長都有抑制作用，其主要機制包括影響細胞的DNA合成、誘導細胞產生凋亡、阻滯細胞周期、抑制腫瘤血管生成、預防腫瘤轉移等。目前尚無補骨脂素誘導胃癌細胞凋亡機制的報道。細胞凋亡時actin細絲發生斷裂，actin網絡結構遭到破壞，這是細胞凋亡時形態改變的一個典型特征，那么通過改變這一典型特征是否就能導致細胞凋亡呢？對此，WHITE S R等[9]作了深入的研究。他們用細胞松弛劑D抑制氣管1HAEo細胞和主支氣管上皮細胞actin的延伸,或通過Jaspakinolide促進actin的聚集，發現改變actin的整體性會導致細胞在5 h內出現典型的凋亡形態學改變。該研究提示，actin可能是細胞凋亡早期的調控物之一，進一步研究表明，通過改變actin穩定狀態，可以導致凋亡的發生[10-11]。F-actin的解聚是凋亡過程中所必須的，其解聚出現在凋亡小體形成之前。actin是Caspases蛋白水解酶的作用底物，當Caspases攻擊actin時，可將其切斷降解為15kD和31kD兩個片段，使之不能重新聚合，并由于15kD片段的形成而引起細胞凋亡形態的改變[12]。本研究發現，Psoralen可抑制胃癌細胞株BGC-803增殖，促進腫瘤細胞凋亡，同時藥物干預后引起了actin狀態的變化,即細胞骨架蛋白F-actin解聚，分析其作用機制可能是藥物引起了F-actin解聚從而導致了凋亡的發生。至于F-actin解聚是否由于Caspases蛋白水解酶作用尚有待進一步研究。

國內外尚無補骨脂素作用于細胞骨架蛋白抗腫瘤的實驗報道，上述研究結果表明，補骨脂素可抑制抑制胃癌細胞的增殖，促進腫瘤細胞凋亡，其作用機制可能是藥物干預后引起了F-actin解聚從而導致了凋亡的發生。本研究結果提示，補骨脂素作為一種有良好活性的抗癌中藥制劑提取物，具有很好的臨床應用和開發價值，但其抗癌作用機理有待進一步深入研究。

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