金龍蛇顆粒對缺氧環境下胃癌BGC-823細胞上皮間質轉化的影響

金龍蛇顆粒對缺氧環境下胃癌BGC-823細胞上皮間質轉化的影響

徐晶鈺，張璇，裴蓓，秦志豐，陸燁，魏品康*

(解放軍第二軍醫大學長征醫院中醫科，上海 200003)

摘要：目的探討金龍蛇顆粒對缺氧狀態下胃癌BGC-823細胞上皮間質轉化(EMT)的影響并初步研究該過程的相關機理。方法將胃癌BGC-823細胞分成3組：常氧對照組、缺氧對照組(加入150 μmol/L的CoCl2)、金龍蛇顆粒含藥血清組。觀察3組細胞形態變化；RT-PCR檢測3組細胞E-cad、N-cad、Vimentin mRNA表達變化。結果常氧對照組的胃癌BGC-823細胞排列較致密，為上皮樣表現；缺氧對照組大部分細胞排列較前松散，形態較前拉長，呈間質樣表現；金龍蛇顆粒含藥血清組介于二者之間。金龍蛇顆粒含藥血清組與缺氧對照組相比，E-cad mRNA表達升高，N-cad、Vimentin mRNA表達降低，差異有顯著統計學意義(P<0.01)。結論金龍蛇顆?？梢种迫毖醐h境中胃癌BGC-823細胞的上皮間質轉化，可能與其下調N-cad、Vimentin mRNA表達，升高E-cad mRNA表達相關。

關鍵詞：金龍蛇顆粒;E-cad;N-cad;Vimentin;上皮間質轉化;缺氧;大鼠

DOI:10.13463/j.cnki.jlzyy.2015.08.023

中圖分類號：R273文獻標志碼： A

文章編號：1003-5699(2015)08-0830-03

基金項目:國家自然科學基金(81302933，81202678)；上海市中醫藥事業發展3年行動計劃(ZYSNXD-CC-ZDYJ024)；第二軍醫大學青年啟動基金(2012QN17)資助。

作者簡介:徐晶鈺(1983-)，男，碩士，主治醫師，主要從事中西醫結合腫瘤防治。

收稿日期:(責任編輯：趙玉芝2014-12-21)

*通信作者:魏品康，電話-(021)81885474，電子信箱-zhangxuan0918@163.com

Jinlongshe Granules on epithelial-mesenchymal transition in gastric

cancer cells BGC-823 under hypoxia microenvironment

XU Jingyu,ZHANG Xuan,PEI Bei,QIN Zhifeng,LU Ye,WEI Pinkang*

(Department of Traditional Chinese Medicine,Changzheng Hospital Affiliated to Second Military

Medical University,Shanghai 200003,China)

Abstract:ObjectiveTo investigate the effects of Jinlongshe granules on EMT of gastric cancer cell BGC-823 under the microenvironment of hypoxia,and to explore the mechanism of the process.MethodsThe cells were divided into three groups:normal control group(cultured under normal condition);hypoxia control group(cultured with CoCl2);Jinlongshe granules group(co-cultured with CoCl2 and Chinese herbal medicine serum).Microscopy was used to observe the different morphological change among the three groups and E-cad,N-cad,Vimentin mRNA were detected by RT-PCR.ResultsThe cells of normal control group became close together like epithelial features;the cells of hypoxia control group became loose like mesenchymal features;the result of Jinlongshe granules group was between the other two groups.RT-PCR showed that the E-cad mRNA of Jinlongshe granules group was raised significant and the N-cad,Vimentin mRNA of Jinlongshe granules group was reduced significant compared with hypoxia control group (P<0.01).ConclusionJinlongshe granules can inhibit the EMT of gastric cancer cell BGC-823 under the microenvironment of hypoxia.The mechanism maybe related to the reduction of N-cad,Vimentin mRNA and raise of E-cad mRNA.

Keywords:Jinlongshe granules;E-cad;N-cad;Vimentin;epithelial-mesenchymal transition;hypoxia;rat

胃癌是國內常見的惡性腫瘤，發病率高居第二位[1]。由于發病時多處于中晚期，其主要治療方式為手術和化療，療效始終不能令人滿意[2]。原發灶的侵襲轉移是致死和導致生活質量下降的重要原因[3]。中醫藥在胃癌輔助治療上具有明顯的優勢，可以對患者整體調節，改善體內環境，毒副作用小，因此研究有效的復方制劑勢在必行[4]。金龍蛇制劑是我科治療胃癌的經驗方，以消痰散結為治則，由魏品康教授經40余年臨床經驗總結而成，療效確切[5]。本研究將從缺氧環境中胃癌細胞上皮間質轉化角度，進一步對金龍蛇顆粒逆轉胃癌細胞侵襲轉移的作用機制進行探討。

1實驗材料

制南星、制半夏、山慈菇等中藥材均購自上海雷允上中藥飲片藥材有限公司，符合2010年版《中華人民共和國藥典》檢測標準，由第二軍醫大學附屬上海長征醫院制劑室制成含生藥材53.3 g/mL的浸膏；CoCl2來自Sigma公司；E-cad抗體、N-cad抗體、Vimentin抗體均來自Abcam公司。二氧化碳培養箱來自SANYO；倒置顯微鏡來自重慶光電有限公司；酶標儀來自普朗DNM-9602。清潔級雄性SD大鼠,280～320 g，由中科院上海試驗動物中心提供，許可證號:SCXK(滬)：2012-0002；胃癌BGC-823細胞，由中科院上海細胞庫提供。

2實驗方法

2.1金龍蛇顆粒含藥血清的制備大鼠隨機分為金龍蛇顆粒組和空白對照組,各5只。金龍蛇顆粒組予中藥浸膏21.36 g/kg灌胃，每天早8點，午1點；空白對照組每次給予生理鹽水2 mL。連續給藥5 d，末次給藥后1 h，麻醉大鼠，摘眼球取血，采血前禁食不禁水12 h,室溫下靜置1 h，5 000 r/min，10 min離心，56 ℃水浴滅活30 min，過濾分裝采用0.22 μm濾膜，存放于-20 ℃。

2.2細胞分組胃癌細胞復蘇，密度調至1×106個/mL后均勻接種于96孔培養板中,培養于37 ℃、5%CO2、含10%胎牛血清的RPMI-1640培養液中。常氧對照組:繼續培養24 h；缺氧模型組:用150 μmol/L CoCl2加入培養基中，再繼續培養24 h；金龍蛇顆粒含藥血清組：先加入含藥血清，再用150 μmol/L CoCl2處理胃癌細胞，置于培養箱內培養。

2.3觀察胃癌BGC-823細胞形態變化按上述分組，倒置顯微鏡觀察細胞形態變化。RT-PCR檢測各組細胞E-Cad、N-cad、Vimentin mRNA表達，按RT-PCR試劑盒說明書進行操作。根據說明書提取RNA，實時定量PCR檢測各目標基因mRNA。內參選用GAPDH，由上海Invitrogen公司設計合成引物。引物序列見表1。

表1　各基因PCR引物序列

3實驗結果

3.1倒置顯微鏡觀察胃癌BGC-823細胞形態變化常氧對照組細胞排列較致密，大部分為上皮細胞表現，缺氧對照組大部分細胞排列較前松散，形態有所改變，較前拉長，呈間質樣表現。金龍蛇顆粒含藥血清組介于二者之間。

3.2RT-PCR檢測金龍蛇顆粒對胃癌BGC-823細胞E-Cad、N-cad、Vimentin mRNA表達的影響見表2。

組 別E-CadN-cadVimentin常氧對照組 1.00±0.00 1.00±0.00 1.00±0.00 缺氧對照組 0.32±0.03#1.65±0.07#1.80±0.08#金龍蛇顆粒血清組0.63±0.05△1.33±0.07△1.39±0.07△

注：與常氧對照組比較，#P<0.01；與缺氧對照組比較，△P<0.01

缺氧對照組與常氧對照組E-cad mRNA表達比較明顯降低，N-cad、Vimentin mRNA表達比較明顯升高，差異有統計學意義；金龍蛇顆粒含藥血清組與缺氧對照組相比，E-cad mRNA表達升高，N-cad、Vimentin mRNA表達降低，差異有統計學意義。

4討論

由于腫瘤惡性增殖，新生血管生成相對不足，使整個腫瘤處于缺氧環境中[6]。缺氧容易導致腫瘤細胞發生上皮間質轉化[7]，而上皮間質轉化又是腫瘤細胞侵襲轉移的重要前提[8]。因此從上皮間質轉化入手，探討抑制胃癌侵襲轉移具有十分明確的現實意義。

細胞發生上皮間質轉化需要特征[9]:1)細胞形態的改變。由緊密排列的立方上皮樣細胞向松散的紡錘間質細胞轉變；2)上皮標記物向間質標記物的轉變。E-cad表達的喪失標志著細胞發生EMT[10];而間質特性的標記物N-cad、Vimentin表達的增高意味著細胞運動能力提高，則更容易發生侵襲轉移[11]。

我科前期已經就“從痰論治胃癌”做了大量研究。魏品康教授在經典痰證理論上進行創新，提出腫瘤“痰污染”學說，并認為腫瘤缺氧微環境也屬于“痰污染”[12]，以消痰散結為治則的金龍蛇顆粒可以清除痰污染，對胃癌療效確切[13]。實驗上可以干擾胃癌細胞增殖[14]；促進胃癌細胞凋亡[15]；抑制胃癌侵襲轉移[16]；影響胃癌新生血管生成[17]等；臨床上可以延長患者生存期，提高患者生活質量[18]等。

相對于缺氧對照組，金龍蛇顆粒不僅能使胃癌細胞形態變化發生部分逆轉，細胞間的聯接由松散變得致密；同時也使上皮間質轉化過程中的上皮樣標記物(E-cad)有所提高，間質樣標記物(N-cad、Vimentin)有所降低，證實了金龍蛇顆粒能逆轉缺氧環境中胃癌細胞上皮間質轉化。

在今后的研究中，我們將進一步探討金龍蛇顆粒逆轉缺氧環境中胃癌細胞上皮間質轉化的機理，這將對從痰論治胃癌侵襲轉移提供新的實驗依據。

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