基于病理學評價淫羊藿女貞子對激素干預哮喘大鼠的影響

基于病理學評價淫羊藿女貞子對激素干預哮喘大鼠的影響

年宏蕾,劉仁慧*,許利平,楊燕,王秀娟*

(首都醫科大學中醫藥學院，中醫絡病研究北京市重點實驗室，北京 100069)

摘要：目的基于病理學評價研究藥對淫羊藿女貞子對激素干預哮喘大鼠的影響。方法卵蛋白致大鼠慢性哮喘模型后，腹腔注射地塞米松模擬激素干預過程，在激素應用同時及撤停時合用中藥淫羊藿女貞子，觀察對肺組織病理、血及肺泡灌洗液(BALF)涂片嗜酸性粒細胞(EOS)數量的影響。結果激素干預組、淫羊藿女貞子合激素Ⅰ、Ⅱ組顯著改善肺組織支氣管黏膜上皮脫落、管腔阻塞程度(分別為0.391±0.200，0.429±0.200，0.429±0.200，P均<0.05)，降低BALF中EOS數量(分別為8.30±2.06，9.70±2.45，10.60±2.32，P<0.05或0.01)及肺組織總管壁厚度(分別為106.26±14.00，95.73±14.78，87.47±14.44，P均<0.01)；激素干預組、淫羊藿女貞子合激素干預Ⅰ組顯著抑制血EOS數量(分別為5.30±2.31，5.50±1.51，P均<0.01)，改善肺組織EOS浸潤(分別為0.420±0.200，0.348±0.200，P均<0.05)；淫羊藿女貞子合激素Ⅰ組可顯著降低肺組織平滑肌厚度(16.46±4.17，P<0.05)。結論激素應用同時配伍淫羊藿女貞子可增強協同抗炎作用及抑制哮喘氣道重塑的作用。

關鍵詞：糖皮質激素；淫羊藿；女貞子；氣道炎癥；氣道重塑；大鼠

DOI:10.13463/j.cnki.jlzyy.2015.08.022

中圖分類號：R285.5文獻標志碼： A

文章編號：1003-5699(2015)08-0826-04

基金項目:國家自然科學基金資助項目(81373814)；北京中醫藥薪火傳承“3+3”工程二室一站建設項目(2012-SZ-C-42)；北京市屬高等學校高層次人才引進與培養計劃項目(SIT&TCD201504097)。

作者簡介:年宏蕾(1991-)，女，碩士研究生，主要從事中藥及復方的藥效及作用機制研究。

收稿日期:(責任編輯：趙玉芝2014-09-04)

*通信作者:劉仁慧，電話-(010)83911639，電子信箱-liurenhui995@163.com

王秀娟，電話-(010)83911624，電子信箱-wxj0517@sina.com

HerbaEpimediiandFructusLigustrilucidion pathology evaluationin

asthmatic rats with hormone intervention

NIAN Honglei,LIU Renhui*,XU Liping,YANG Yan,WANG Xiujuan*

(School of Traditional Chinese Medicine,Capital Medical University;

Beijing Key Laboratory of Traditional Chinese Medicine Collateral Disease Theory Research,Beijing 100069,China)

Abstract:ObjectiveTo investigate the effects of the combination of Herba Epimedii,Fructus Ligustrilucidi and glucocorticoids(GC) on the pathology change in the asthmatic rats.MethodsRat asthmatic model was established by sensitization and challenge with ovalbumin(OVA).Dexamethasone was injected into asthmatic rats with the oral gavage of Epimedium and Ligustrumlucidum at different treatment stage of GC withdraw.The pathological changes of lung tissue and the eosinophils (EOS) number in the branchoalveolar lavage fluids(BALF) and blood were observed.ResultsThe GC group and the first and second groups of the combination of Herba Epimedii,Fructus Ligustrilucidi and GC alleviated bronchial mucosa epithelial shedding and lumenobstruction (0.391±0.200,0.429±0.200,0.4290±0.200,P<0.05),reduced the EOS number in BALF (8.30±2.06,9.70±2.45,10.60±2.32,P<0.05 or 0.01),and decreased the total bronchial wall area in the lung tissue (106.26±14.00,95.73±14.78,87.47±14.44,P<0.01).The GC group and the first group of the combination of Herba Epimedii,Fructus Ligustrilucidi and GC reducedthe EOS number inthe blood (5.30±2.31,5.50±1.51,P<0.01) and the EOS infiltration in the lung tissue (0.42±0.200,0.348±0.200,P<0.05).The first group of the combination of Herba Epimedii,Fructus Ligustrilucidi and GC can reduce the smooth musche area in the lung tissue (16.46±4.17,P<0.05).ConclusionsThe combination of Herba Epimedii,Fructus Ligustrilucidi and GC hasbetter anti-inflammatory effects on the asthmatic model of rats,and play a protective role in inhibiting airway remodeling.

Keywords:asthma;glucocorticoids;Herba Epimedii;FructusLigustri Lucidi;airway inflammation;airway remodeling;rat

哮喘是全球范圍內嚴重威脅公眾健康的一種常見慢性病[1]，目前針對哮喘發病機制中氣道炎癥學說，糖皮質激素(glucocorticoids,GC)被認為是防治哮喘的首選藥物，但能否有效抑制氣道重塑尚存在爭議[1-2]，且實踐中使用GC也存在諸多不良反應[3]。現代學者認為，外源性超生理劑量的GC類同于“壯火”，發越腎氣、腎精，致火旺陰傷，日久累及腎陽，最終形成陰陽兩虧[4-5]，防治GC的不良反應當以補腎中陰陽為基本立法。課題組前期研究發現，平補腎中陰陽的藥對淫羊藿女貞子能夠協同激素抗炎，并拮抗激素不良反應[6-8]。本研究通過觀察與氣道炎癥、氣道重塑相關的病理學改變，評價藥對協同激素治療哮喘的療效。

1材料

SPF級健康雄性SD大鼠，體質量(120±10) g，由北京維通利華實驗動物技術有限公司提供，合格證號SCXK(京)2007-0001。402A超聲霧化器(江蘇魚躍醫療設備股份有限公司)；NIS-Elements BR 3.2圖像分析軟件、尼康(Nikon)ECLIPSE 80i生物顯微鏡(北京銳馳恒業儀器科技有限公司);萊卡2016型切片機(上海萊卡儀器有限公司)。女貞子、淫羊藿中藥材均購自北京同仁堂藥店；卵清白蛋白(OVA)、氫氧化鋁凝膠(美國Sigma公司)；地塞米松磷酸鈉注射液(天津藥業焦作有限公司，批號10081711)。

2方法

2.1動物分組篩選合格動物60只，按照隨機數字表法分為6組，即正常對照組(1組)、哮喘模型組(2組)、激素干預組(3組)，淫羊藿女貞子組(4組)，淫羊藿女貞子合激素干預Ⅰ組(5組)、合激素干預Ⅱ組(6組)，每組10只。

參考文獻2.2造模及給藥方法[9]于實驗1～35 d，除正常對照組外，其余動物全部造模。在普通哮喘模型制備成功的基礎上，各造模組均每周2次給予1%OVA霧化吸入直至結束。實驗36～49 d(激素撤停前階段)，3、5、6組腹腔注射地塞米松注射液0.5 mg/kg，1次/d；實驗50～77 d(激素撤停中階段)，每周遞減腹腔注射地塞米松0.1 mg/kg。4組在哮喘模型處理的基礎上，于實驗36 d分別開始灌胃淫羊藿女貞子水溶液(9.5 g/kg)；5、6組在相應GC組處理的基礎上,分別于實驗36、50 d開始給予淫羊藿女貞子水溶液(9.5 g/kg)。

2.3標本采集與檢測78 d處死動物，尾部取血作血涂片；開胸，取肺組織連同氣管，結扎左主支氣管，剪取左肺；右肺行支氣管肺泡灌洗術，回收支氣管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid，BALF)，分離BALF沉淀涂片。血及BALF涂片作瑞氏染色，記錄嗜酸性粒細胞(eosinophils，EOS)數目。左肺行肺組織HE染色，行氣道炎癥半定量分析[10];計算支氣管基底膜周徑(Pbm)、標準化氣道總管壁厚度(Wat)及標準化平滑肌厚度(Wam)[11],基于各組動物之間Pbm差異顯著(P<0.01)，采取Pbm、Wat及Wam值除以相應動物體質量(kg)為最終標準化值，評價對氣道重塑的影響作用。

3結果

3.1各組大鼠血及BALF涂片EOS計數的比較見表1。

表1　各組大鼠血及BALF涂片EOS計數的比較

注：與1組比較，##P<0.01；與2組比較，△P<0.05，△△P<0.01

3.2各組大鼠肺組織病理學半定量統計結果見表2～5，圖1。2組支氣管黏膜上皮水腫、增生程度，支氣管黏膜上皮脫落、管腔阻塞程度，支氣管壁炎性細胞浸潤程度,EOS增多程度較1組差異有統計學意義。與2組比較，3、5、6組支氣管黏膜上皮脫落、管腔阻塞程度有顯著改善；3、5組能抑制肺組織EOS浸潤。

表2　各組大鼠支氣管黏膜上皮水腫、增生程度的比較 ± s, n=8)

表3　各組大鼠支氣管黏膜上皮脫落、管腔阻塞程度的比較 ± s, n=8)

表4　各組大鼠支氣管壁炎性細胞浸潤程度的比較 ± s, n=8)

表5　各組大鼠EOS浸潤程度的比較

注：1)與1組比較，#P<0.05；與2組比較，△P<0.05。2)半定量采用Ridit分析法，以合計數為標準組計算。3)平均級數計算是將各分級分別計分為0、1、2、3，計算平均分。

圖1　支氣管肺組織HE染色照片(×200)

3.3各組大鼠支氣管壁總厚度和平滑肌厚度的比較見表6。各組之間Pbm值無顯著差異。與1組比較，2組Wat值、Wam值均顯著增高(P<0.05或0.01)；與2組比較，3、5、6組可顯著降低Wat值(P<0.01)；5組可顯著降低Wam值(P<0.05)；與3組比較，各給藥組均可顯著降低Wam值(P<0.05或0.01)。

組 別Pbm(μm/kg)Wat/〔μm2/(μm·kg)〕Wam/〔μm2/(μm·kg)〕1組2617±245117.24±13.41 15.53±2.29 2組2810±244141.61±26.21# 22.02±6.14## 3組2535±253106.26±14.00△△24.75±3.18 4組2778±206144.12±27.23 20.29±4.62 5組2580±38995.73±14.78△△16.46±4.17△▲▲6組2567±45387.47±14.44△△19.07±4.97▲

注：與1組比較，#P<0.05，##P<0.01；與2組比較，△P<0.05，△△P<0.01；與3組比較，▲P<0.05，▲▲P<0.01

4討論

慢性氣道炎癥是哮喘產生的病理基礎,以氣道內大量EOS浸潤為主；氣道重塑是哮喘發生和發展的重要環節，是慢性炎癥反復損傷和修復的結果，導致不可逆性氣流阻塞和增加氣流阻力，同時還加重氣道高反應性[12-13]，是頑固性哮喘的主要原因之一[14]。哮喘的評價標準以組織學病理改變為主，基本的病理改變包括慢性剝脫性嗜酸細胞性支氣管炎及氣道重建[15]。本實驗結果表明，哮喘大鼠肺組織中支氣管黏膜上皮水腫、增生，支氣管黏膜上皮脫落、管腔阻塞，伴炎性細胞浸潤，且支氣管壁Wat值、Wam值均顯著增高，血及BALF中EOS數量升高，提示哮喘大鼠存在以EOS增高為主要特征的氣道炎癥改變及氣管壁、平滑肌增厚為評價指標的氣道重塑。經藥物治療后，激素組對肺組織支氣管黏膜上皮脫落、管腔阻塞程度有顯著改善，并顯著降低血及BALF中EOS數量;淫羊藿女貞子合激素Ⅰ組顯著緩解肺組織支氣管黏膜上皮脫落、管腔阻塞程度，降低血及BALF中EOS,并可顯著降低Wat值及Wam值；淫羊藿女貞子合激素Ⅱ組對肺組織支氣管黏膜上皮脫落、管腔阻塞程度有改善，并降低BALF中EOS數量及支氣管壁Wat值。提示地塞米松對哮喘氣道炎癥有明顯的改善作用，但對氣道重塑沒有明顯的作用；淫羊藿女貞子協同激素共用，對哮喘的氣道炎癥及氣道重塑均有顯著改善作用,且淫羊藿女貞子合激素干預Ⅰ組抑制Wam的作用更優，提示中藥淫羊藿女貞子在激素應用早期介入，不僅可協同激素抗炎，并可抑制哮喘的氣道重塑的病理改變。

參考文獻：

[1]吳寒,史鎖芳.激素依賴性哮喘中醫藥防治研究進展[J].江西中醫藥,2006,37(10):59-60.

[2]李海燕,楊佩蘭,黃海茵,等.全蝎-蜈蚣藥對對哮喘模型大鼠氣道炎癥及氣道重塑的影響[J].中國實驗方劑學雜志,2013,19(1):206-210.

[3]ADCOCK I M,LANE S J.Corticosteroid-insensitive asthma:molecular mechanisms[J].Journal of Endocrinology,2003,178(3):347-355.

[4]吳斌.糖皮質激素副作用的中醫藥研究進展[J].時珍國醫國藥,2010,21(3):719-721.

[5]張金良,王憲波,曾輝.從中醫學角度談糖皮質激素副作用的藥理機制[J].北京中醫藥,2010,29(4):276-279.

[6]劉仁慧,王秀娟,袁穎,等.淫羊藿、女貞子對激素干預哮喘大鼠骨代謝的影響[J].吉林中醫藥,2012,32(5):490-492.

[7]劉仁慧,許利平,王秀娟,等.淫羊藿女貞子合用地塞米松抗哮喘大鼠的研究[J].中國中藥雜志,2012,37(10):1497-1499.

[8]劉仁慧,陳忻,許利平,等.淫羊藿女貞子對激素干預哮喘大鼠模型氣道炎癥的影響研究[J].中華哮喘雜志(電子版),2012,6(6):415-419.

[9]劉仁慧,王秀娟,許利平,等.培本方對哮喘模型大鼠的藥效學研究[J].中成藥,2010,32(5):741-746.

[10]何權瀛,穆魁津.小氣道功能異常與病理變化之間關系的初步探討[J].醫學研究通訊,1983,8(7):11-13.

[11]BAI A,EIDELMAN D H,HOGG J C,et al.Proposed nomenclature for quantifying subdivisions of the bronchial wall[J].Journal of Applied Physiology,1994,77(2):1011-1014.

[12]仝惠民.辛伐他汀對豚鼠哮喘模型氣道炎癥和重塑的影響及機制[D].天津:天津醫科大學,2013.

[13]金延燕.瓜子金對支氣管哮喘模型小鼠的氣道炎癥和氣道重塑的治療作用及作用機制[D].延吉:延邊大學,2013.

[14]劉中成,張艷芬.一種大鼠慢性哮喘模型的建立與評價[J].藥學學報,2010(6):718-723.

[15]鄭仰明,李昌崇,張維溪,等.哮喘氣道重塑大鼠氣道上皮細胞凋亡及布地奈德的干預作用[J].中國循證兒科雜志,2006,1(2):106-112.