通蓮湯對裸小鼠胃癌移植瘤生長及缺氧誘導因子-1α的影響

通蓮湯對裸小鼠胃癌移植瘤生長及缺氧誘導因子-1α的影響

張艷麗1，賈永森2，秦麗娟3，孫瑞軍3

(1.遷安燕山醫院，河北 遷安 064400；2.河北聯合大學中醫學院，河北 唐山 063000；

3.河北聯合大學基礎醫學院，河北 唐山 063000)

摘要：目的探討復方通蓮湯對胃癌MGC803細胞荷瘤裸鼠的抑瘤作用及對缺氧誘導因子-1α(HIF-1α)表達的影響,為該方臨床應用提供實驗依據。方法胃癌細胞株MGC803接種于裸鼠右前肢皮下。模型組灌胃生理鹽水溶液10 mL/kg，陽性對照組灌胃消癌平片1.8 g(生藥量)/kg的藥液10 mL/kg, 復方通蓮湯高、中、低劑量組分別灌胃1.5，0.75，0.375 g(生藥量)/L的藥液10 mL/kg，各組連續給藥3周，再連續觀察3周,6周后處死小鼠，分離瘤組織，計算抑瘤率，免疫組織化學法檢測腫瘤組織HIF-1α表達。結果高劑量通蓮湯顯著抑瘤生長，瘤重(1.51±0.49) g，抑瘤率為(61.04±4.79)%，與模型組比較差異有統計學意義(P<0.05)；通蓮湯可顯著抑制HIF-1α表達，與模型組比較，陽性表達率χ2=4.286，P=0.038<0.05。結論通蓮湯可抑制裸鼠人胃癌MGC803細胞移植瘤生長，其抑瘤機制與下調腫瘤細胞HIF-1α蛋白表達有關。

關鍵詞：通蓮湯；胃癌；MGC803細胞；荷瘤裸鼠；缺氧誘導因子-1α

DOI:10.13463/j.cnki.jlzyy.2015.08.025

中圖分類號：R285.5文獻標志碼： A

文章編號：1003-5699(2015)08-0837-04

基金項目:河北省自然科學基金(H2013209053)。

作者簡介:張艷麗(1980-)，女，醫學碩士，主治醫師，主要從事中醫內科學研究。

收稿日期:(責任編輯：趙玉芝2014-10-08)

*通信作者:賈永森，電子信箱-jysen@163.com

Tonglian Decoction on tumor growth and HIF-1α expression of tumor tissue

from nude mice modeled with gastric cancer cells

ZHANG Yanli1,JIA Yongsen2,QIN Lijuan3,SUN Ruijun3

(1.Yanshan Hospital of Qian’an,Qian’an,064400,Hebei Province,China;

2.Traditional Chinese Medicine College,Hebei United University,Tangshan 063000,Hebei Province,China;

3.School of Basic Medicine,Hebei United University,Tangshan 063000,Hebei Province,China)

Abstract:ObjectiveThe purpose of the research is to observe inhibition of Tonglian Decoction (TD) on nude mice modeled with gastric cancer cells MGC-803 and on hypoxia inducible factor-1α (HIF-1α) expression in tumor tissue,to provide experimental basis for clinical application of TD.MethodsMGC-803 cells are inoculated subcutaneously in right forelimbs of all mice.Mice in model group are treated with saline solution 10 mL/kg orally.Mice in positive control group are treated with Xiaoaiping tablet,dosage of 10 mL/kg,1.8 g/kg (crude drug) of liquid.Mice in TD groups are subdivided as high (1.5 g/L),medium (0.75 g/L) and low (0.375 g/L) dose group of drug liquid,with dosage of 10 mL/kg.All mice take administration for 3 weeks and are observed for another 3 weeks continuously.Tumor volumes are measured for 6 weeks everyday from the beginning of MGC803 cells transplanted.All mice are killed for isolation of tumor tissue,inhibition ratio of tumor-weight measured.Finally,HIF-1α expression is examined with immunohistochemistry.ResultsTumor weight in TD high-dose group is (1.51±0.49) g,and the inhibition ratio is (61.04±4.79)%,which is significantly different from that in the model group (P<0.05);Positive rate of HIF-1α expression also decreased significantly,showing statistical difference from the model group (χ2=4.286,P=0.038<0.05).ConclusionTD inhibits tumor growth on nude mice modeled with MGC803,through downregulation of HIF-1α protein expression.

Keywords:Tonglian Decoction;gastric cancer;MGC803 cells;nude mice transplanted with tumor;HIF-1α

胃癌是消化系統常見的惡性腫瘤，雖然綜合治療使得胃癌5年生存率有所提高,但患者預后效果仍然較差[1]。研究表明[2]，血管生成與胃癌發生及發展有密切的關系,缺氧誘導因子-1α(HIF-1α)過度表達是促使腫瘤細胞生成、增殖的重要因素之一[3]。HIF-1α作為新近發現的促血管生長因子,可為抗血管生成治療提供新的作用機制研究。

中醫藥治療胃癌具有優勢,表現在個體化、多靶點控制腫瘤生長[4]。根據該病中醫基本病機，在“通幽湯”(《脾胃論》)基礎上，結合現代中藥藥理研究成果，自擬“通蓮湯”以益氣活血、解毒散結，獲得國家發明專利[5]。體外實驗研究表明,該方可顯著抑制胃癌MGC803細胞增殖[6],其抑癌機制與下調NF-κB信號通路IKKβ和NF-κB蛋白有關[7]。本研究通過荷瘤裸鼠實驗，進一步觀察了通蓮湯對胃癌瘤體的抑制作用以及對HIF-1α的影響，以豐富該方防治胃癌的分子機制。

1材料

4～5周齡裸鼠(BALBc nu/nu)，雌、雄各半，體質量18～22 g，購于中國食品藥品檢定研究院，合格證號:SCXK(京)2009-0017；裸鼠在層流架內飼養，恒溫22～25 ℃、恒濕(55±5)%，所有食物和水均滅菌后使用。MGC803人胃癌細胞株，由中國醫學科學院基礎醫學研究所細胞中心提供。通蓮湯(生地黃、當歸、升麻、檳榔、通關藤、半枝蓮、白花蛇舌草等)，各單味藥物均購于北京同仁堂唐山連鎖藥店有限公司，提取液含生藥材1.5 g/mL。消癌平片，批號110706，南京圣和制藥有限公司。鼠抗人HIF-1α抗體(28 b,Santa Cruz生物科技公司)，新生小牛血清(GIBCO公司)，DMEM培養基(GIBCO公司)，胰蛋白酶(GIBCO公司)；MTT(Amresco公司)，DMSO(Amresco公司)。1100型無菌超凈臺(FORMA公司)，NOVAPATH 450酶標光度計(Bio-Tek公司)，3336 CO2培養箱(FORMA公司)，TMD-2倒置式顯微鏡(NIKON公司)，3MK型低溫高速離心機(SIGMA公司)，JJ-2型組織勻漿機(Waring公司)。

2方法

2.1方藥配制各味中藥以紗布過濾掉藥物雜質，并加入30倍體積超純水，浸泡30 min，100 ℃溫浸6 h，4層醫用紗布過濾，收集藥液，入燒杯中濃縮至200 mL，冷卻至室溫，4 ℃ 12 000 r/min離心15 min 2次，吸取藥液上清，0.22 μm濾器濾過后，加熱濃縮收膏，計算提取物濃度，以生理鹽水(NS)配至10 mg/mL，1.5 mL離心管分裝，-20 ℃保存備用。

2.2細胞培養以10%小牛血清DMEM培養液8 mL，接種MGC803細胞于Φ100 mm培養皿中,置于37 ℃，5%飽和濕度的CO2培養箱孵育。

2.3分組及給藥裸小鼠50只，隨機分為5組，每組10只,分別為模型對照組，陽性對照藥(消癌平)組，通蓮湯高、中、低劑量組。將MGC803細胞傳代至對數生長期，消化離心，計數，以1×107/mL的濃度接種于裸鼠右前肢皮下。模型對照組灌胃NS10 mL/kg;陽性藥組灌胃消癌平片水溶液(生藥量)1.8 g/kg，通蓮湯高、中、低劑量組(生藥量，下同)分別灌胃1.5，0.75，0.375 g/L的藥液(以NS配成)，消癌平、通蓮湯給藥量均為10 mL/kg。各組均連續給藥3周，后續觀察3周后，裸鼠脫臼處死。

2.4檢測指標

2.4.1計算抑瘤率裸鼠處死后，取腫瘤組織皮下完整剝取腫瘤組織，剔除纖維包膜,于電子天平上稱取瘤重，計算抑瘤率[8]。抑瘤率=〔(模型組平均瘤重-處理組平均瘤重)/模型組平均瘤重〕×100%

2.4.2形態學觀察取部分剝離的瘤組織以10%中性福爾馬林固定，石蠟包埋、制成4 μm厚的切片、HE染色、光鏡下觀察瘤組織細胞形態[9]。

2.4.3免疫組化法測定HIF-1α用40 g/L甲醛固定瘤塊,石蠟包埋、切片。免疫組織化學法步驟按說明書進行，所有切片均在同一光強度，同一放大倍數下進行圖像分析，染色陽性物質呈棕黃色顆粒狀，位于細胞核內，只要有明確陽性產物即作為陽性細胞。表達率測定:每例標本在400倍光鏡下，隨機計數20個視野，記錄每個視野的陽性表達率(陽性細胞數/全視野細胞數)，取其均數作為每例樣本陽性表達率的評定依據。所占比率為0～5%為陰性(-),5%～25%為弱陽性(+)，25%～50%為中度陽性(++)，50%以上為強陽性(+++)[10]。

2.5統計學方法采用SPSS 18.0統計軟件進行數據分析，組間差別顯著性檢驗采用單因素方差分析；以P<0.05為差異有統計學意義。

3結果

3.1各藥抑瘤率模型組和通蓮湯中、低劑量組裸鼠瘤體重量較大；消癌平組，通蓮湯高劑量組瘤重較小。通蓮湯高劑量組、消癌平組與模型組相比，有顯著性差異(P<0.05),兩者抑瘤率均達到60%以上；通蓮湯高劑量組與消癌平組作用相當。如表1。

表1　各組瘤體平均瘤重及抑瘤率 ± s)

注：與模型組比較，#P<0.05

3.2皮下移植瘤組織形態學觀察模型組瘤組織內瘤細胞核大畸形、核仁深染，腺體擁擠，血竇豐富；通蓮湯高劑量組、消癌平組的腫瘤細胞呈圓形或橢圓形，淡染，核分裂少見，可見較多腫瘤細胞腫脹變性壞死；間質中的淋巴細胞及單核細胞數量較模型組明顯升高。通蓮湯中、低劑量組細胞多數深染，可見小片狀壞死區，與模型組相似。如圖1。

3.3皮下移植瘤組織中HIF-1α蛋白的表達模型組、通蓮湯中、低劑量組瘤體HIF-1α陽性表達率無顯著性差異；通蓮湯高劑量組、消癌平組HIF-1α陽性表達率與模型組相比均有顯著性差異(P<0.05)，其中，通蓮湯高劑量組與模型組比較陽性表達率χ2=4.286，P=0.038<0.05，說明通蓮湯高劑量組均有較好穩定下調HIF-1α表達的作用。如圖2和表2。

表2　各組荷瘤裸鼠瘤體組織HIF-1α陽性表達

注：與模型組比較，#P<0.05

圖1　皮下移植瘤組織形態學病理切片(×100)

圖2　各組癌組織HIF-1α表達(×100)

4討論

通蓮湯是依據“金元四大家”之一李東垣所創“通幽湯”加味化裁而來[11]，專為胃癌氣陰虧虛、瘀血內結而設。鑒于該復方組成藥物均為天然中藥材，實驗中選擇同為中藥屬性的烏骨藤有效提取物——消癌平作為陽性對照藥，許多基礎和臨床研究表明，其對胃癌具有確切療效[12-13]。

本研究采用源于臨床患者的人胃癌MGC803細胞，裸鼠皮下移植成瘤，觀察通蓮湯的抗癌作用。抑瘤率結果提示，通蓮湯高劑量組、消癌平組抑瘤明顯，抑瘤率達到60%左右,與模型組比較差異有統計學意義(P<0.05)，通蓮湯中、低劑量組抑瘤率維持在20%～40%，與模型組比較無統計學差異。結果表明，高劑量通蓮湯抑瘤生長作用較顯著。

組織形態學檢測結果顯示，通蓮湯高劑量組、消癌平組與模型組相比，瘤體組織結構改變較明顯，瘤組織內有大片壞死區，表明兩藥對瘤細胞生長有明顯的抑制作用，與抑瘤率測定結果一致。

惡性腫瘤快速生長使腫瘤細胞處于缺氧微環境中，胞內高表達的HIF-1α是主要的氧調節亞基，可以調節腫瘤細胞適應低氧狀態[14]，誘導多個相關基因表達[15-16]，促進腫瘤血管生成[17]，從而促進腫瘤的浸潤和轉移[18]。本研究通過免疫組化研究顯示，高劑量的通蓮湯、對照藥消癌平可顯著抑制癌組織HIF-1α的表達，與模型組比較有顯著性差異(P<0.05)。結果提示，通蓮湯通過下調HIF-1α表達，從而抑制腫瘤血管生成。

綜上所述，通蓮湯有較好的抑制胃癌荷瘤裸小鼠瘤體生長作用，其抑瘤作用機制與下調瘤體組織內HIF-1α蛋白表達有關。

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