GLP-1受體激動(dòng)劑對(duì)肥胖小鼠脂肪組織的脂解作用及機(jī)制探討

GLP-1受體激動(dòng)劑對(duì)肥胖小鼠脂肪組織的脂解作用及機(jī)制探討*

林倍思，許海霞，梁華，曾可靜，艾鶴英，翁建平，徐芬△

(中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院內(nèi)分泌科，廣東省糖尿病防治重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510630)

[摘要]目的： 探討胰高血糖素樣肽1(GLP-1)受體激動(dòng)劑艾塞那肽(exendin-4)對(duì)肥胖小鼠脂肪組織的作用及機(jī)制。方法: 8周齡C57BL/6J小鼠高脂喂養(yǎng)12周后隨機(jī)分為艾塞那肽組和生理鹽水對(duì)照組，另設(shè)正常飲食組。取附睪旁脂肪檢測(cè)sirtuin 1(SIRT1)、脂肪甘油三酯脂酶(ATGL)、腫瘤壞死因子α(TNF-α)及脂聯(lián)素mRNA的表達(dá)。Exendin-4或聯(lián)合SIRT1激動(dòng)劑/抑制劑處理3T3-L1脂肪細(xì)胞24 h；小鼠胚胎成纖維細(xì)胞(MEF)誘導(dǎo)成脂肪細(xì)胞后exendin-4干預(yù)24 h；檢測(cè)SIRT1、ATGL和激素敏感性脂酶(HSL)的蛋白表達(dá)水平。結(jié)果: 與生理鹽水對(duì)照組相比，艾塞那肽組小鼠附睪旁脂肪量、空腹血糖及血甘油三酯水平降低(均P<0.05)，體重減輕，血TNF-α水平降低。艾塞那肽干預(yù)后，肥胖小鼠脂肪組織SIRT1、ATGL和脂聯(lián)素 mRNA表達(dá)明顯上調(diào)，TNF-α mRNA表達(dá)明顯下調(diào)(P<0.05)。Exendin-4劑量依賴性促進(jìn)3T3-L1脂肪細(xì)胞SIRT1、ATGL和HSL脂解相關(guān)蛋白的表達(dá)。聯(lián)合SIRT1激動(dòng)劑后，脂滴數(shù)量減少，上述脂解相關(guān)蛋白的表達(dá)上調(diào)。聯(lián)合SIRT1抑制劑后上述作用減弱。敲除SIRT1后MEF脂肪細(xì)胞內(nèi)脂滴增大，數(shù)量增多，exendin-4促進(jìn)脂解的作用消失。結(jié)論: 艾塞那肽通過(guò)激活SIRT1促進(jìn)肥胖小鼠脂肪組織脂解作用。

[關(guān)鍵詞]胰高血糖素樣肽1； Sirtuin 1； 脂解作用； 肥胖

[中圖分類號(hào)]R589.2; R363.2[文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A

doi:10.3969/j.issn.1000-4718.2015.11.016

[文章編號(hào)]1000-4718(2015)11-2027-06

[收稿日期]2015-04-30[修回日期] 2015-06-05

[基金項(xiàng)目]*國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No. 81100275)

通訊作者△Tel: 023-63693332; E-mail: sunnyzhangx@gmail.com

Effect of GLP-1 receptor agonist on lipolysis in adipose tissue of obese mice and its underlying mechanismLIN Bei-si, XU Hai-xia, LIANG Hua, ZENG Ke-jing, AI He-ying, WENG Jian-ping, XU Fen

(DepartmentofEndocrinology,ThirdAffiliatedHospital,SunYat-senUniversity,GuangdongProvincialKeyLaboratoryofDiabetology,Guangzhou510630,China.E-mail:xufen3@mail.sysu.edu.cn)

ABSTRACT[]AIM: To investigate the effects of glucagon-like peptide-1 (GLP-1) receptor agonist exendin-4 on white adipose tissue (WAT) and the underlying mechanisms. METHODS: Male C57BL/6J mice (8 weeks) were challenged by high-fat diet for 12 weeks, and were randomly divided into saline group and exendin-4 group. The mRNA expression of sirtuin 1 (SIRT1), adipose triglyceride lipase (ATGL), TNF-α and adiponectin of WAT was detected by real-time PCR. 3T3-L1 adipocytes or mouse embryonic fibroblasts cells were treated with exendin-4 for 24 h. The protein levels of SIRT1, ATGL and hormone-sensitive lipase (HSL) were determined by Western blot.RESULTS: Exendin-4 significantly decreased epididymal fat weight, fasting blood glucose and serum triglyceride levels (P<0.05), and reduced body weight and serum TNF-α level. The mRNA expression of SIRT1, ATGL and adiponectin in WAT was all significantly up-regulated by exendin-4, which were contrary to the down-regulation of TNF-α mRNA expression (P<0.05). Exendin-4 promoted the protein expression of SIRT1, ATGL, and HSL in 3T3-L1 adipocytes in a dose-dependent manner. Less lipid droplets with up-regulation of lipolytic protein expression were observed when combined with SIRT1 agonist treatment, which were suppressed by SIRT1 inhibitor. Deletion of SIRT1 led to larger adipocytes with more lipid droplets, and the effect of exendin-4 on the lipolysis disappeared when SIRT1 was deficient.CONCLUSION: Exendin-4 promotes lipolysis in WAT of obese mice via activation of SIRT1.

[KEY WORDS]Glucagon-like peptide-1; Sirtuin 1; Lipolysis; Obesity

艾塞那肽(exendin-4,Exe)是一種胰高血糖素樣肽1(glucagon-like peptide-1，GLP-1)受體激動(dòng)劑，近來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，這類藥物不僅具有葡萄糖依賴性促胰島素分泌等降糖作用，在調(diào)控脂質(zhì)代謝方面也發(fā)揮了重要作用。研究表明，GLP-1受體激動(dòng)劑在減少體重指數(shù)(body mass index，BMI)、腰圍、腰臀比和腹脂含量的同時(shí)，還可改善外周組織的脂質(zhì)代謝及胰島素敏感性[1]。作為體內(nèi)最大的脂肪儲(chǔ)存器官，在肥胖狀態(tài)下，脂肪組織過(guò)度增生肥大，使其功能受損并導(dǎo)致全身脂質(zhì)代謝紊亂，參與并加速肥胖并發(fā)癥病理過(guò)程[2]。然而，關(guān)于GLP-1對(duì)脂肪組織的作用目前尚存在爭(zhēng)議。因此，本研究擬通過(guò)構(gòu)建高脂飲食誘導(dǎo)的肥胖小鼠模型及3T3-L1脂肪細(xì)胞模型，探討艾塞那肽對(duì)脂肪組織脂代謝的影響及其可能的分子機(jī)制。

材料和方法

1動(dòng)物模型的建立及干預(yù)方法

8周齡雄性C57BL/6J小鼠15只(南京動(dòng)物模式研究所)，根據(jù)體重按隨機(jī)數(shù)字表法分組為正常飲食組(5只)和高脂飲食組(10只)，分別給予普通飼料(58%碳水化合物，13%脂肪，29%蛋白質(zhì))和高脂飼料(26%碳水化合物，58%脂肪，16%蛋白質(zhì))喂養(yǎng)。高脂飲食喂養(yǎng)12周誘導(dǎo)肥胖模型后，艾塞那肽干預(yù)組腹腔注射艾塞那肽(24 nmol/kg，Lilly)4周，正常飲食組及生理鹽水組腹腔注射生理鹽水對(duì)照。動(dòng)物行麻醉后處死， ELISA法測(cè)血甘油三酯(trigly-ceride，TG)和TNF-α水平。以上實(shí)驗(yàn)經(jīng)中山大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)。

23T3-L1前脂肪細(xì)胞的誘導(dǎo)分化及干預(yù)

參考Anil等[3]方法，將3T3-L1前脂肪細(xì)胞誘導(dǎo)分化成3T3-L1脂肪細(xì)胞。分為正常對(duì)照組、exendin-4(Sigma)組、exendin-4聯(lián)合sirtuin 1(SIRT1)激動(dòng)劑白黎蘆醇(resveratrol，Res;Sigma)組和exendin-4聯(lián)合SIRT1抑制劑sirtinol(Selleck)組，干預(yù)24 h。

3實(shí)驗(yàn)方法

3.1原代小鼠胚胎成纖維細(xì)胞(mouse embryonic fibroblasts，MEF)分離培養(yǎng)及干預(yù) 取13.5 d小鼠胚胎，去除胎鼠頭、尾巴、四肢及內(nèi)臟，余下胚胎軀干部分充分剪碎，加入3 mL胰酶于37 ℃水浴振蕩12 min后，加入胎牛血清終止消化。 4 ℃離心10 min，棄上清，用PBS漂洗2次后，將重懸的細(xì)胞接種于10 cm培養(yǎng)皿，傳代2次后接種于6孔板，誘導(dǎo)分化為成熟脂肪細(xì)胞[4]。取頭部組織提取DNA，用PCR擴(kuò)增目的條帶進(jìn)行小鼠基因型的鑒定。每種基因型(野生型和SIRT1-/-純合子型)均設(shè)正常對(duì)照組和exendin-4組，干預(yù)24 h。

3.2檢測(cè)mRNA表達(dá)提取小鼠附睪旁脂肪組織總RNA，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA擴(kuò)增。Real-time PCR擴(kuò)增體系為SYBR Premix Ex Taq(2×)10 μL，SIRT1、脂肪甘油三酯脂酶(adipose triglyceride lipase,ATGL)、TNF-α 及脂聯(lián)素上、下游引物(具體序列見(jiàn)表1)各0.4 μL，cDNA 2 μL，加單蒸水7.5 μL至總體積20 μL。擴(kuò)增條件為95 ℃30 s；95 ℃5 s，60 ℃20 s，40循環(huán)；65 ℃15 s，40 ℃30 s。用2-ΔΔCt比較法計(jì)算目的基因的轉(zhuǎn)錄水平。

表1　引物序列

F: forward; R: reverse.

3.3Western blot法檢測(cè)蛋白表達(dá)提取3T3-L1脂肪細(xì)胞或MEF誘導(dǎo)分化后脂肪細(xì)胞總蛋白，測(cè)蛋白濃度后取40 μg蛋白總量上樣電泳，110 V恒壓轉(zhuǎn)膜90 min，室溫下5%脫脂奶粉封閉1 h，分別加入SIRT1、ATGL和激素敏感性脂酶(hormone-sensitive lipase,HSL) (CST) I 抗4 ℃過(guò)夜。 TBST緩沖液洗膜3次，加入 II 抗室溫孵育1 h，再用 TBST洗膜3次，用Odyssey紅外熒光成像系統(tǒng)掃描并灰度分析，計(jì)算目的蛋白與內(nèi)參蛋白相對(duì)灰度值，每組重復(fù)實(shí)驗(yàn)次數(shù)≥3次。

3.4油紅染色及定量分析將3T3-L1細(xì)胞株或原代MEF細(xì)胞誘導(dǎo)分化為成熟脂肪細(xì)胞后，PBS沖洗后用10%中性甲醛溶液室溫下固定30 min，再用避光過(guò)濾后的油紅工作液染色1 h，用顯微鏡觀察并拍照(ZEISS)。拍照結(jié)束每孔加125 μL的異丙醇室溫下10 min以萃取脂滴中的油紅，將萃取液轉(zhuǎn)移至96孔板于490 nm處測(cè)定吸光度值。

4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用SPSS 13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)或均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差誤(mean±SEM)表示，多組定量資料比較用單因素方差分析，多組間均數(shù)兩兩比較用Bonferroni校正的t檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

1艾塞那肽對(duì)肥胖小鼠脂肪量及血生化指標(biāo)影響

與正常對(duì)照組小鼠相比，高脂組小鼠體重及附睪旁脂肪量顯著增加，空腹血糖、血清甘油三酯及炎癥指標(biāo)TNF-α明顯升高(P<0.05)。艾塞那肽干預(yù)后，高脂組小鼠附睪旁脂肪量、空腹血糖及血甘油三酯水平降低(P<0.05)，體重減輕，血TNF-α水平降低，見(jiàn)表2。

表2　艾塞那肽對(duì)肥胖小鼠脂肪量及血生化指標(biāo)的影響

*P<0.05vsNC group;#P<0.05vsHF group.

2艾塞那肽對(duì)肥胖小鼠脂肪組織各目標(biāo)基因mRNA表達(dá)的影響

與正常對(duì)照組相比，高脂組小鼠脂肪組織SIRT1、ATGL和脂聯(lián)素的mRNA表達(dá)下調(diào)，TNF-α的mRNA表達(dá)明顯上調(diào)。艾塞那肽干預(yù)后，高脂組小鼠脂肪組織SIRT1、ATGL和脂聯(lián)素的mRNA表達(dá)上調(diào)，TNF-α的mRNA表達(dá)明顯下調(diào)(P<0.05)，見(jiàn)表3。

表3　艾塞那肽對(duì)肥胖小鼠脂肪組織各目標(biāo)基因mRNA表達(dá)的影響

*P<0.05vsNC group;#P<0.05vsHF group.

3Exendin-4對(duì)3T3-L1脂肪細(xì)胞干預(yù)結(jié)果

3.1形態(tài)學(xué)觀察3T3-L1前脂肪細(xì)胞誘導(dǎo)分化為成熟脂肪細(xì)胞后，胞質(zhì)內(nèi)脂滴油紅染色后鏡下觀察顯示為紅色。Exendin-4干預(yù)24 h后，脂肪細(xì)胞內(nèi)脂滴生成減少。Exendin-4聯(lián)合SIRT1激動(dòng)劑白黎蘆醇后，上述作用更加明顯。而exendin-4聯(lián)合SIRT1抑制劑sirtinol處理后，與exendin-4單獨(dú)處理組相比，脂肪細(xì)胞內(nèi)脂滴生成明顯增多。定量分析結(jié)果與形態(tài)學(xué)一致,見(jiàn)圖1。

3.2蛋白檢測(cè)結(jié)果分析隨著exendin-4濃度升高，3T3-L1脂肪細(xì)胞的脂解相關(guān)指標(biāo)SIRT1、ATGL和HSL的蛋白表達(dá)量呈現(xiàn)劑量依賴性遞增的趨勢(shì)。聯(lián)合SIRT1激動(dòng)劑后，上述脂解指標(biāo)的蛋白表達(dá)量升高更加明顯；而exendin-4聯(lián)合SIRT1抑制劑后，與exendin-4單獨(dú)處理組相比，上述脂解指標(biāo)的蛋白表達(dá)量下降,見(jiàn)圖1、2。

4Exendin-4對(duì)分化后MEF脂肪細(xì)胞干預(yù)結(jié)果

4.1形態(tài)學(xué)觀察將原代分離MEF細(xì)胞誘導(dǎo)為脂肪細(xì)胞，胞質(zhì)內(nèi)脂滴油紅染色后鏡下觀察顯示為紅色。Wild-type組exendin-4干預(yù)后胞質(zhì)內(nèi)脂滴生成減少。SIRT1-/-組脂滴生成明顯增多。SIRT1-/-組exendin-4干預(yù)后，脂滴生成未見(jiàn)明顯變化。定量分析結(jié)果與形態(tài)學(xué)一致，見(jiàn)圖3。

4.2蛋白檢測(cè)結(jié)果分析Wild-type組exendin-4干預(yù)后脂解相關(guān)指標(biāo)SIRT1、ATGL和HSL的蛋白表達(dá)量升高。在敲除SIRT1后，exendin-4促進(jìn)脂解指標(biāo)蛋白表達(dá)的作用消失，見(jiàn)圖3。

討論

最早發(fā)現(xiàn)腸道在口服營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的刺激下能夠產(chǎn)生各種內(nèi)分泌因子，后者可通過(guò)促進(jìn)胰島素分泌達(dá)到降糖作用。GLP-1被證明為其中的一種內(nèi)分泌因子。由于天然GLP-1半衰期極短，僅為1～2 min，因此衍生出GLP-1相關(guān)類藥物。作為最早上市的GLP-1受體激動(dòng)劑，越來(lái)越多的研究發(fā)現(xiàn)，艾塞那肽除了有降低血糖的作用外，還可顯著降低肥胖人群的體重及脂代謝紊亂[5]。此外，在高脂誘導(dǎo)的肥胖動(dòng)物模型上，艾塞那肽可顯著改善外周組織如肝臟、肌肉的脂質(zhì)沉積，改善胰島素敏感性[6-7]。然而，關(guān)于艾塞那肽對(duì)白色脂肪組織的研究卻相對(duì)較少，尚存在爭(zhēng)議。早期研究發(fā)現(xiàn)，在分離的原代人和大鼠脂肪細(xì)胞上，GLP-1呈現(xiàn)cAMP依賴性的脂解作用，當(dāng)聯(lián)合GLP-1受體拮抗劑后，上述脂解作用消失[8]。然而，Bertin 等[9]通過(guò)將含有GLP-1的林格氏溶液灌注人皮下脂肪組織發(fā)現(xiàn)，GLP-1對(duì)脂肪組織的脂質(zhì)合成及脂解作用并無(wú)影響。因此，對(duì)于GLP-1相關(guān)藥物對(duì)脂肪組織脂質(zhì)代謝的影響及機(jī)制探討仍有待進(jìn)一步研究。

SIRT1是一種NAD+依賴性的組蛋白脫乙酰化酶，可參與調(diào)控多種生物學(xué)功能，如糖脂代謝，能量利用和癌癥等。早期研究發(fā)現(xiàn)，SIRT1可通過(guò)抑制脂肪細(xì)胞中過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體γ的表達(dá)，減少脂質(zhì)合成[10]。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，激活SIRT1可改善高脂喂養(yǎng)肥胖小鼠全身脂代謝紊亂[11]。此外，在分化成熟的3T3-L1脂肪細(xì)胞模型上發(fā)現(xiàn)，SIRT1可增加FOXO1去乙酰化水平，激活A(yù)TGL，促進(jìn)脂肪細(xì)胞的脂質(zhì)分解[12]。這些研究提示，SIRT1在參與全身脂質(zhì)代謝的調(diào)控中扮演了重要角色。

Figure 1.The effects of exendin-4 (Exe) on the morphological changes and the protein expression of SIRT1, ATGL and HSL in 3T3-L1 adipocytes, either combined with SIRT1 agonist or SIRT1 inhibitor. Mean±SEM.n=3.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsExe group.

圖1Exendin-4或聯(lián)合SIRT1激動(dòng)劑/SIRT1抑制劑對(duì)3T3-L1脂肪細(xì)胞形態(tài)學(xué)及SIRT1、ATGL和HSL蛋白表達(dá)的影響

Figure 2.The effects of exendin-4 (Exe) on the protein expression of SIRT1, ATGL and HSL in 3T3-L1 adipocytes.Mean±SEM.n=3.*P<0.05vs0 nmol/L group.

圖2Exendin-4對(duì)3T3-L1脂肪細(xì)胞SIRT1、ATGL和HSL蛋白表達(dá)的影響

Figure 3.The effects of exendin-4 (Exe) on the morphological changes and the protein expression of SIRT1, ATGL and HSL in MEF after induced into adipocytes. Mean±SEM.n=3.*P<0.05vswild-type control group;#P<0.05vsSIRT1-/-control group;△P<0.05vsSIRT1-/-Exe group.

圖3Exendin-4對(duì)分化后MEF形態(tài)學(xué)及SIRT1、ATGL和HSL蛋白表達(dá)的影響

ATGL及HSL是甘油三酯水解步驟中的關(guān)鍵酶，其主要作用是促進(jìn)脂肪細(xì)胞中甘油三酯逐步水解為甘油單酯及游離脂肪酸，后者釋放入血，為外周組織提供能量供應(yīng)。在3T3-L1脂肪細(xì)胞中過(guò)表達(dá)ATGL可使培養(yǎng)基中甘油及游離脂肪酸含量增加，同時(shí)胞內(nèi)脂滴大小顯著下降。相反，在脂肪細(xì)胞中沉默ATGL后，細(xì)胞內(nèi)脂滴的體積顯著增加[13]。此外，在ATGL敲除及HSL敲除的小鼠模型上均發(fā)現(xiàn)，敲除后小鼠脂肪水解能力被破壞，表現(xiàn)為小鼠脂肪組織的體積增大，并在外周多個(gè)臟器中發(fā)現(xiàn)異位脂質(zhì)沉積，進(jìn)而引發(fā)多器官代謝障礙，使小鼠存活率下降[14]，這說(shuō)明脂肪細(xì)胞的脂質(zhì)代謝失衡與全身代謝紊亂密切相關(guān)。

肥胖人群脂肪組織過(guò)度增生不僅可引起全身脂代謝紊亂，還可導(dǎo)致脂肪組織間質(zhì)的炎癥浸潤(rùn)，以及分泌炎癥因子釋放入血，使全身胰島素敏感性下降。研究發(fā)現(xiàn)，在分化成熟的3T3-L1脂肪細(xì)胞上，GLP-1受體激動(dòng)劑可以通過(guò)激活蛋白激酶A，促進(jìn)脂肪細(xì)胞分泌脂聯(lián)素，從而提高胰島素的敏感性[15]。此外，GLP-1受體激動(dòng)劑還可減少2型糖尿病人群脂肪組織中巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)，從而減輕脂肪組織的炎癥狀態(tài)，并且這種作用是不依賴于GLP-1受體激動(dòng)劑降糖降脂的作用的[16]。

本研究發(fā)現(xiàn)，GLP-1受體激動(dòng)劑艾塞那肽可促進(jìn)脂肪組織脂解作用，并且這種作用依賴SIRT1介導(dǎo)。在抑制SIRT1表達(dá)或敲除SIRT1基因后，艾塞那肽上述脂解作用減弱或消失。此外，艾塞那肽在促進(jìn)脂肪組織脂解的同時(shí)，還可改善肥胖小鼠全身糖脂代謝紊亂及胰島素抵抗，減輕炎癥狀態(tài)。相信隨著對(duì)GLP-1受體激動(dòng)劑作用研究的深入，我們對(duì)這類藥物改善脂質(zhì)代謝的作用機(jī)制將有更深入的了解，也為伴有肥胖的2型糖尿病患者的用藥提供新的理論依據(jù)。

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(責(zé)任編輯： 林白霜， 羅森)