miR-21在周圍神經損傷時調控雪旺細胞凋亡

miR-21在周圍神經損傷時調控雪旺細胞凋亡*

陸新華，王輝△，寧昕杰，羅駿成，梁家驥

(中山大學附屬第三醫院神經外科，廣東 廣州 510630)

[摘要]目的： 探討周圍神經損傷時，微小RNA-21(microRNA-21,miR-21)與雪旺細胞(SC)凋亡的關系及相關分子機制。 方法: 采用實時熒光定量PCR(real-time PCR)檢測動物模型中miR-21以及人第10號染色體缺失的磷酸酶及張力蛋白同源基因(phosphatase and tensin homologue deleted on chromosome 10，PTEN)的表達情況；通過將miR-21類似物(miR-21-mimic)、miR-21抑制物(miR-21-inhibitor)和陰性對照miRNA(negative control miRNA，NC-miRNA)轉染入RSC96細胞中，構建出過表達miR-21的雪旺細胞株(MI-SC)、抑制miR-21表達的雪旺細胞株(IN-SC)及表達對照miRNA的雪旺細胞株(NC-SC)；采用流式細胞儀檢測3組細胞的凋亡情況； real-time PCR檢測3組細胞中miR-21以及PTEN的表達情況；Western blot檢測3組細胞中PTEN及凋亡相關蛋白激活型caspase-3(cleaved caspase-3)的表達情況。結果: 神經損傷組miR-21的表達量與對照組相比明顯升高，神經損傷組PTEN mRNA的表達水平與對照組相比明顯降低；與NC-SC相比，上調miR-21組細胞的凋亡比例減少，PTEN mRNA及蛋白的表達水平降低，cleaved caspase-3的表達水平降低，下調miR-21組細胞的凋亡比例增加，PTEN mRNA及蛋白的表達水平升高，cleaved caspase-3的表達水平升高(P<0.05)。結論: miR-21可能通過下調PTEN的表達抑制雪旺細胞的凋亡，從而可能在周圍神經的損傷修復中發揮作用。

[關鍵詞]周圍神經損傷； 微小RNA-21； 雪旺細胞； 細胞凋亡

[中圖分類號]R363[文獻標志碼]A

doi:10.3969/j.issn.1000-4718.2015.11.020

[文章編號]1000-4718(2015)11-2053-06

[收稿日期]2015-04-29[修回日期] 2015-07-28

[基金項目]*國家自然科學基金資助項目(No. 81173580)

通訊作者△Tel: 0411-87586009; E-mail: jingxianyang@yahoo.com

miR-21 inhibits apoptosis of Schwann cells following peripheral nerve injuryLU Xin-hua, WANG Hui, NING Xin-jie, LUO Jun-cheng, LIANG Jia-ji

(DepartmentofNeurosurgery,TheThirdAffiliatedHospital,SunYat-senUniversity,Guangzhou510630,China.E-mail:doctorwanghui@126.com)

ABSTRACT[]AIM: To explore the relationship and molecular mechanism between microRNA-21(miR-21) and Schwann cells (SC) following peripheral nerve injury. METHODS: The mRNA expression of miR-21 and phosphatase and tensin homologue deleted on chromosome ten (PTEN) in animal model were detected by real-time PCR. The over-expression of miR-21 and inhibition of miR-21 expression in the Schwann cells according to transfection of lentiviral vectors were performed, the nonspecific miRNA was used as a negative control (NC). The cell apoptosis was measured by flow cytometry. The mRNA expression of miR-21 and PTEN in the cells was detected by real-time PCR. The protein expression of PTEN and cleaved caspase-3 was determined by Western blot. RESULTS: The level of miR-21 was significantly higher and the mRNA level of PTEN was significantly lower in the model of nerve injury than those in control group. miR-21 over-expression decreased the number of apoptotic Schwann cells compared with NC-SC. The mRNA expression of PTEN was down-regulated by over-expression of miR-21. The protein expression of PTEN and cleaved caspase-3 was down-regulated by over-expression of miR-21 (P<0.05). CONCLUSION: miR-21 may play an important role in the peripheral nerve injury through inhibiting apoptosis of Schwann cells by down-regulating the expression of PTEN.

[KEY WORDS]Peripheral nerve injury; MicroRNA-21; Schwann cells; Apoptosis

眾所周知，周圍神經損傷后是可修復再生的，而作為周圍神經系統的主體細胞，雪旺細胞(Schwann cells ，SC)在其中發揮了重要作用。周圍神經損傷后,SC十分活躍[1-2]，包括增殖并趨化巨噬細胞、分泌神經營養因子及細胞外基質及與再生軸突形成縫隙連接和緊密連接等。這對于維持神經元的存活，引導軸突再生，促進髓鞘成熟至關重要，從而在周圍神經修復再生中發揮作用。然而由于內外環境因素的影響，以及對其修復再生的機制尚未完全清楚，加之周圍神經特殊的解剖結構和功能，使得目前臨床采用的各種神經修復及吻合技術效果都不十分理想，功能恢復欠佳[3]。為此，周圍神經損傷后修復再生的影響因素及細胞分子機制還有待進一步研究。

微小RNA(microRNA,miRNA)是近年來新發現的一類非編碼小分子RNA，長度約為22～28個核苷酸，廣泛存在于真核生物中。miRNA通過與靶mRNA的3’UTR完全或不完全的互補結合，導致靶mRNA降解或翻譯抑制，從而調控靶基因的表達，影響細胞增殖、分化和凋亡[4]。有研究指出，在神經系統領域，miRNA參與細胞生長、增殖、分化、遷移、凋亡[5]以及神經突再生[6]。miRNA在周圍神經再生中的作用近年來也受到關注[7-8]。有研究指出，在中樞神經系統損傷后，如脊髓挫裂傷、創傷性腦損傷以及腦缺血后，miR-21的表達量升高[9-14]，而在周圍神經系統，切斷大鼠坐骨神經后，miR-21的表達明顯升高，且能促進軸突再生[15-16]。我們前期的研究工作已證實miR-21可在SC中表達[17]。然而目前的研究均未對miR-21與SC的關系及分子機制進行深入探討。

本實驗中，我們旨在研究miR-21對SC凋亡的調控及分子機制。通過研究我們發現，miR-21可能通過下調人第10號染色體缺失的磷酸酶及張力蛋白同源基因(phosphatase and tensin homologue deleted on chromosome 10，PTEN)的表達抑制雪旺細胞的凋亡，從而可能在周圍神經損傷的修復再生中發揮作用。

材料和方法

1材料

30只150～180 g雄性實驗用SD大鼠購自中山大學北校區動物實驗中心；RSC96雪旺細胞株購自中國科學院細胞庫；DMEM/F12培養基、胎牛血清(HyClone)；RNA抽提試劑、RNA逆轉錄試劑盒、SYBR Premix Ex TaqTM熒光定量PCR試劑盒(TaKaRa)；miR-21、U6、PTEN、GAPDH逆轉錄引物及引物對(上海吉瑪生物公司)；Lipofectamine 2000、miR-21類似物(mimic)、抑制物(inhibitor)及陰性對照序列(negative control miRNA， NC- miRNA)(Invitrogen)；細胞凋亡檢測試劑盒Annexin V-PE/7-AAD、全蛋白提取試劑盒、BCA蛋白含量檢測試劑盒、ECL檢測試劑盒(南京凱基生物公司)；PTEN和cleaved caspase-3兔抗鼠單克隆抗體(CST)；GAPDH兔抗鼠多克隆抗體(廣州杰特偉生物公司)；HRP標記羊抗兔IgG(北京博奧森生物公司)；0.22 μm PVDF膜(Millipore)。

2方法

2.1神經損傷模型建立將30只雄性成年SD大鼠隨機分為神經損傷組、假手術組和正常對照組。靜脈復合麻醉，左下肢做縱切口，逐層分離，暴露坐骨神經上段。損傷模型組分離外膜后完全橫斷坐骨神經后逐層縫合組織；假手術組逐層暴露坐骨神經后縫合組織；正常對照組不做處理。7 d后檢測miR-21以及PTEN的mRNA表達水平。

2.2細胞培養RSC96細胞用含10%胎牛血清的DMEM/F12培養基，在37 ℃、5% CO2、飽和濕度的細胞培養箱中培養，含EDTA的0.25%胰酶消化傳代。

2.3細胞轉染將狀態良好、對數生長期RSC96細胞于轉染前24 h接種于6孔板中，培養至細胞達80%融合度時進行細胞轉染，嚴格按照操作說明將帶有綠色熒光蛋白的miR-21-mimic、miR-21-inhibitor和NC-miRNA轉染入RSC96細胞中，構建出過表達miR-21的SC株(MI-SC)、抑制miR-21表達的SC株(IN-SC)及表達對照miRNA的SC株(NC-SC)。37 ℃、5% CO2、飽和濕度的細胞培養箱中繼續培養，倒置相差顯微鏡觀察拍攝，采用Image J software進行GFP陽性細胞數檢測。

2.4流式細胞術檢測細胞凋亡用不含EDTA的胰酶消化收集細胞。用預冷的PBS洗滌細胞2次，每次均在2 000 r/min,離心5 min，收集(1～5)×105細胞。在50 μL的binding buffer中加入5 μL 7-AAD染液，混勻；收集細胞中加入上述7-AAD染液，混勻，室溫，避光反應5～15 min；反應后再加450 μL的binding buffer混勻；加入1 μL Annexin V-PE混勻，室溫，避光反應5～15 min；樣品在1 h 內用流式細胞儀檢測。結果用FlowJo軟件分析，Q2代表早期凋亡，Q3代表晚期凋亡。

2.5Real-time PCR檢測細胞中miR-21以及PTEN的表達提取RNA：用TRIzol提取細胞及組織總RNA，經分光光度計檢測，A260/A280值為1.8～2.0的用于cDNA合成。逆轉錄反應:按說明進行，反應條件為：37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s。PCR按說明進行，反應條件為：95 ℃30 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 34 s，擴增40個循環。miR-21以及PTEN的相對表達量采用2-ΔΔCt法計算。miR-21相對表達量：ΔCt=CtmiR-21-CtU6，ΔΔCt=ΔCt實驗組-ΔCt對照組；PTEN相對表達量：ΔCt=CtPTEN-CtGAPDH，ΔΔCt=ΔCt實驗組-ΔCt對照組。miR-21、PTEN、U6和GAPDH相應的逆轉錄引物以及PCR引物系列[10]見表1。

表1　miR-21、PTEN、U6和GAPDH的引物系列

2.6Western blot檢測PTEN及凋亡相關蛋白cleaved caspase- 3的表達收集細胞，用全蛋白提取試劑盒提取蛋白質樣品。用BCA法在酶標儀上用A562 nm波長測定總蛋白濃度。樣本經過SDS-PAGE分離蛋白后，再用電轉儀以200 mA 恒流90 min轉印至PVDF膜，5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，TBST洗膜3次, 每次5 min,分別加入cleaved caspase-3、PTEN和GAPDH的 I 抗，4 ℃搖床孵育過夜，TBST洗膜3次，每次5 min。再加HRP標記的Ⅱ抗室溫孵育1 h，TBST洗膜3次，每次5 min。ECL化學發光試劑盒顯影。

3統計學處理

數據均以均數±標準差(mean±SD)表示，所得數據均采用SPSS 13.0統計軟件進行分析。3組之間均數的比較采用單因素方差分析及Bonferroni法。以P<0.05為差異有統計學意義。

結果

1miR-21以及PTEN在神經組織中的表達

Real-time PCR檢測結果顯示神經損傷組中miR-21的表達量明顯高于假手術組和正常對照組(P<0.01)；但PTEN的表達量明顯低于假手術組和正常對照組(P<0.05)；假手術組和正常對照組中miR-21以及PTEN的表達量相近，見圖1。

Figure 1.The relative expression of miR-21 was higher but the mRNA relative expression of PTEN was lower in model group than those in control groups. Mean±SD.n=3.*P<0.05,**P<0. 01vsmodel group．

圖1Real-time PCR檢測神經組織中miR-21以及PTEN的表達

2miR-21在3組細胞中的表達

倒置相差顯微鏡拍攝細胞轉染結果顯示，3 組細胞的轉染率均在90%以上，見圖2。MI-SC細胞中miR-21表達量明顯高于NC-SC細胞，IN-SC細胞中miR-21表達量明顯低于NC-SC細胞，(P<0.01)，見圖3。

Figure 2.Transfection efficiency of miR-21 in NC-SC cells, MI-SC cells and IN-SC cells(×100).

圖2NC-SC、MI-SC和IN-SC 3組細胞的轉染情況

Figure 3.The relative expression of miR-21 in NC-SC, MI-SC and IN-SC cells was detected by real-time PCR. Mean±SD.n=3.**P<0.01vsNC-SC group．

圖3Real-time PCR檢測NC-SC、MI-SC和IN-SC 3組細胞中miR-21的表達

3miR-21對SC凋亡的影響

流式細胞術檢測細胞凋亡的結果顯示，IN-SC細胞凋亡比例明顯高于NC-SC細胞，MI-SC細胞凋亡比例明顯低于NC-SC細胞(P<0.05)，見圖4。

4miR-21對細胞中PTEN mRNA表達水平的影響

MI-SC細胞中PTEN的表達量明顯低于NC-SC細胞(P<0.01)，而IN-SC細胞中PTEN的表達量高于NC-SC細胞(P<0.05),見圖5。

5miR-21對細胞中PTEN及cleaved caspase- 3蛋白表達水平的影響

Western blot 檢測結果顯示，與NC-SC組細胞相比，MI-SC組細胞中的PTEN和cleaved caspase-3 蛋白表達量明顯下降(P<0.01)；與NC-SC組細胞相比，IN-SC組細胞中的PTEN和cleaved caspase-3 蛋白表達量明顯升高(P<0.05)，見圖6。

討論

周圍神經損傷后修復再生是神經科學的重點也是難點[18]。SC作為周圍神經系統的主體細胞，在周圍神經損傷修復再生中發揮著重要作用[1-2]，可以說，周圍神經修復再生的研究在相當程度上是對SC的研究。然而目前對于SC的認識仍比較膚淺，如SC凋亡的分子調控機制如何?其下游的具體信號通路如何?這些都還有待進一步研究。

有研究指出，miRNA可能在周圍神經的損傷修復中發揮重要作用，坐骨神經損傷后，損傷處miR-21的表達量升高最明顯[15-16]。miR-21是一種位于17q23.2染色體FRA17B脆性區域上,且具有自主轉錄單位的miRNA[19]，大量實驗證明在多種腫瘤細胞中miR-21的表達均出現顯著異常，參與調控多種抑癌基因的表達，提示miR-21作為一個致癌miRNA，在多種腫瘤疾病的發生和發展中發揮著重要的作用[20]。此外，也有研究指出，miR-21可能在心血管疾病、腎臟疾病以及免疫系統疾病中發揮作用[21]。然而它是如何在周圍神經系統中發揮作用以及作用機制如何尚不清楚。本研究中，我們發現過表達miR-21能夠抑制SC的凋亡，這或許是它在周圍神經修復再生中發揮作用的關鍵。

進一步研究我們發現，miR-21可能通過下調PTEN的表達從而抑制SC的凋亡。有研究指出，大約有2/3的miR-21的潛在靶基因與細胞凋亡的信號通路相關[22]。利用miRander、PicTar和TargetScan 3種miRNA常用靶基因預測軟件對miR-21的靶基因進行預測，查閱相關文獻，以及利用KEGG信號通路數據庫對預測基因進行分析，我們發現，PTEN與細胞的生長及凋亡關系密切。PTEN基因是第1個具有雙特異性磷酸酶活性的抑癌基因，不僅參與細胞周期的調控，而且調節細胞的正常生長和發育，最終促進細胞凋亡。大量的研究已證明PTEN主要通過使3,4,5,-三磷酸脂酰肌醇去磷酸化，達到阻止細胞生長和促進細胞凋亡的目的。PTEN基因是繼p53之后,另一個在腫瘤細胞中突變與缺失較為廣泛，與細胞的生長及凋亡關系密切的抑癌基因。近來有研究指出，在結直腸癌中，過表達PTEN聯合鋰可以促進細胞凋亡[23]。本研究中，過表達miR-21后PTEN的mRNA及蛋白表達水平明顯降低，其下游的細胞凋亡相關蛋白cleaved caspase-3的表達量也明顯降低，而下調miR-21后PTEN的mRNA及蛋白表達水平明顯升高，其下游的細胞凋亡相關蛋白cleaved caspase-3的表達量也明顯升高。

Figure 4.The effects of miR-21 transfection on the apoptosis of Schwann cells detected by flow cytometry．Mean±SD.n=3.*P<0.05vsNC-SC group.

圖4流式細胞術檢測3組細胞的凋亡情況

Figure 5.The relative expression of PTEN in NC-SC, MI-SC and IN-SC cells was detected by real-time PCR. Mean±SD.n=3.*P<0.05,**P<0.01vsNC-SC group．

圖5Real-time PCR檢測NC-SC、MI-SC和IN-SC 3組細胞中PTEN的表達

Figure 6.The relative expression of PTEN and cleaved caspase-3 in NC-SC, MI-SC and IN-SC cells detected by Western blot. Mean±SD.n=3.*P<0.05,**P<0.01vsNC-SC group．

圖6Western blot檢測NC-SC、MI-SC和IN-SC 3組細胞中PTEN及cleaved caspase-3的蛋白表達

總之，通過實驗我們發現，miR-21可以通過下調PTEN的表達減少雪旺細胞的凋亡，從而可能在周圍神經修復再生中發揮作用。由于目前尚處于體外實驗階段，對于miR-21能否在體內促進神經修復再生，還有待實驗進一步驗證。

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(責任編輯： 陳妙玲， 余小慧)