PLCE1調控p53誘導食管癌細胞凋亡的實驗研究

網絡出版時間：2014-12-4 13:45網絡出版地址：http://www.cnki.net/kcms/doi/10.3969/j.issn.1001-1978.2015.01.018.html

PLCE1調控p53誘導食管癌細胞凋亡的實驗研究

李昀，張軍航, 安軍，何錦園，黃邵洪

(中山大學附屬第三醫院心胸外科，廣東 廣州510630)

中國圖書分類號：R329.25；R345.61；R735.102.2；R977.3

摘要:目的探討磷脂酶Cε1(PLCE1)基因抑制食管癌細胞凋亡的作用機制。方法選用人食管癌細胞株OE33和CP-C作為研究對象。采用qRT-PCR、Western blot法分別檢測轉染PLCE1 siRNA前、后食管癌細胞OE33和CP-C中PLCE1、p53 mRNA和蛋白水平的表達；甲基化特異性PCR重亞硫酸鹽法檢測p53啟動子區甲基化狀態；流式細胞儀檢測細胞凋亡。結果食管癌細胞株OE33和CP-C均高表達PLCE1，抑制PLCE1表達后食管癌細胞CP-C中p53表達上調并促進p53去甲基化，細胞凋亡明顯增加。結論PLCE1通過促進p53啟動子區甲基化抑制p53 的表達，從而抑制食管癌細胞凋亡。

關鍵詞：食管癌；磷脂酶Cε1；p53；細胞凋亡；小干擾RNA；表觀遺傳學

doi:10.3969/j.issn.1001-1978.2015.01.018

文章編號：

文獻標志碼：A1001-1978(2015)01-0082-05

收稿日期:2014-09-20,修回日期:2014-10-12

基金項目：中山大學“985工程”工程項目(No 82000-31101301)

作者簡介：李昀(1981-)，男，博士，主治醫師，研究方向：胸部腫瘤發病機制，E-mail: yunmao@163.com；

通訊作者黃邵洪(1976-)，男，博士，主治醫師，研究方向：胸部腫瘤基礎與臨床，,E-mail: legendhuang@126.com

Abstract:AimTo investigate the role of phospholipase C epsilon 1 (PLCE1) in modulating the apoptotic mechanism in esophageal cancer (Eca) cells. MethodsEca cell lines, OE33 and CP-C cells were cultured to assess the expression of PLCE1. siRNA suppress expression of PLCE1. The expression of PLCE1 and p53 was evaluated by quantitative real time PCR and Western blot. Methylation analyses of p53 were performed by bisulfite conversion of genomic DNA. Apoptosis was assessed by flow cytometry. ResultsOE33 and CP-C cells expressed high levels of PLCE1. Knockdown of PLCE1 markedly increased the expression and hypomethylation of p53, and increased the frequency of apoptosis. ConclusionPLCE1 suppresses apoptosis of Eca cells via promoting p53 promoter methylation and inhibiting expression of p53.

食管癌是我國常見的惡性腫瘤之一，發病率居惡性腫瘤第5位，死亡率居第4位[1]，5年生存率低于15%[2]，但其發病機制尚不十分清楚，且目前的治療效果不甚理想。

在正常生理狀態下，細胞分化與凋亡維持在平衡狀態。當細胞不能接受信號啟動凋亡，處于無限生長狀態就可能引起腫瘤的發生。如抑癌基因p53表達降低與多種腫瘤發生密切相關，包括食管癌。p53可引起細胞周期阻滯、凋亡及維持基因組穩定性從而抑制腫瘤[3]，但是p53在食管癌中失活的機制有待進一步闡明。

磷脂酶Cε1(phospholipase C epsilon 1，PLCE1)是近年發現的磷脂酶C家族的新成員，其定位的染色體是最近發現的食管鱗癌易感位點。PLCE1在細胞信號轉導過程中起重要作用，調節細胞生長、增殖、分化，影響細胞骨架改變、細胞運動、細胞凋亡、腫瘤生長及發展等生物學行為。本研究擬通過檢測PLCE1在食管癌細胞株OE33和CP-C中的表達，驗證改變PLCE1表達對食管癌細胞功能的影響，初步闡明PLCE1通過p53途徑在食管癌細胞中發揮作用的機制。

1材料與方法

1.1試劑PLCE1抗體(sc-28402)、p53抗體(sc-6243)、兔抗羊(sc-276)及羊抗兔二抗(sc-2004)、β-actin抗體(sc-130301)、PLCE1 siRNA(sc-44024)和對照siRNA(sc-37007)購自Santa Cruz Biotech。Annexin V試劑盒購自Sigma。DNA純化盒購自Promega。甲基化檢測盒購自Clontech。轉染試劑lipofectamine2000、質粒抽提試劑盒、qRT-PCR和Western blot所用試劑均購自Invitrogen。PLCE1過表達載體(pcDNA3.1-PLCE1 )由中山大學腫瘤醫院劉曉萍博士惠贈。

1.2細胞株、培養及轉染食管癌細胞株OE33、CP-C及正常細胞株HEK293均購于中科院上海細胞庫，用含10%胎牛血清、2 mmol·L-1谷氨酰胺、100 kU·L-1青霉素和0.1%鏈霉素的DMEM細胞培養液，在二氧化碳培養箱內(37℃、5%CO2、飽和濕度)連續培養并傳代。培養液每3 d換液1次。當細胞長至瓶底80%時進行處理。細胞轉染，根據轉染試劑說明書進行，分別將siRNA及對照無關系列或PLCE1過表達載體、對照載體轉染至食管癌細胞中，并設空白對照；轉染48 h后提取總RNA或進行細胞凋亡檢測，轉染72 h后提取細胞總蛋白。

1.3實時熒光定量PCR法(qRT-PCR)TRIzol法提取細胞總RNA并定量；按試劑盒說明進行逆轉錄合成cDNA。應用實時熒光定量RT-PCR檢測，β-actin作為內參。PCR引物：p53：上游引物5′-GGAAATCTCACCCCATCCCA-3′，下游引物 5′-CAGTAAGCCAAGATCACGCC-3′；PLCE1：上游引物5′-GAGCTGCAATCGAAGTCTGG-3′， 下游引物 5′-AAGGCCTTCTGTGAGTCCTC-3′； β-actin(上游引物5′-CTCCATCCTGGCCTCGCTGT-3′， 下游引物 5′-GCTGTCACCTTCACCGTTCC-3′)。反應體系為20 μL，反應條件為95℃ 3 min預變性，95℃ 10 s，55℃ 30 s，39個循環，并在每個循環延伸末端點收集熒光信號，繪制擴增曲線，基因的表達量用2-ΔΔCt表示。

1.4Western blot預冷PBS洗滌細胞3次，加入全蛋白裂解液后冰上裂解10 min收集蛋白。將抽提蛋白用BCA法定量后，取50 μg于100 V泳道進行SDS-PAGE；電泳結束后，以90 V、90 min將蛋白轉移至PVDF膜； 5%TBS牛奶室溫封閉1 h，孵育一抗羊抗p53(1 ∶1 000)、兔抗PLCE1 (1 ∶500)4 ℃過夜，二抗(兔抗羊1 ∶5 000、羊抗兔1 ∶2 000)室溫孵育1 h。每次抗體孵育后用TBST洗膜15 min，共3次。ECL試劑盒進行發光反應，壓片、顯影、定影，觀察蛋白印跡并進行圖像分析。

1.5細胞凋亡檢測根據試劑盒進行操作，收集CP-C細胞先用Annexin V染色，再用碘化丙啶 (propidium iodide，PI，5 mg·L-1，15 min)染色。流式細胞儀檢測細胞凋亡率，PI+細胞首先被檢出，Annexin V+細胞頻數在剩余細胞中確定。

2結果

2.1PLCE1在食管癌細胞中高表達本研究檢測了食管癌細胞株OE33和CP-C細胞中PLCE1的表達。結果發現，OE33和CP-C細胞中PLCE1的mRNA和蛋白表達水平明顯高于正常細胞HEK293，差異有統計學意義(P<0.01)(Fig 1)。

2.2抑制PLCE1促進食管癌細胞凋亡將PLCE1 siRNA轉染至食管癌CP-C細胞中，抑制PLCE1的表達，檢測細胞凋亡情況。結果表明，PLCE1 siRNA組細胞凋亡率最高，空白對照組(mock)與轉染無關系列組(scramble)差異無顯著性，PLCE1 siRNA與其它兩組比較差異有統計學意義(P<0.01)(Fig 2)。

2.3抑制食管癌細胞中PLCE1表達可促進p53表達進一步采用qRT-PCR與Western blot檢測PLCE1對食管癌CP-C細胞中p53表達的影響。結果發現，抑制CP-C細胞中PLCE1的表達后，p53表達上調。而在HEK293細胞過表達PLCE1后，p53表達下調(Fig 3)。

2.4PLCE1調節p53啟動子甲基化甲基化特異性PCR結果提示HEK293細胞中甲基化狀態的p53 小于20%，而CP-C細胞中，甲基化狀態的p53 大于75%。干擾CP-C細胞中PLCE1表達后，p53啟動子甲基化狀態明顯下調，而HEK293細胞過表達PLCE1后，p53啟動子高甲基化(Fig 4)。

3討論

食管癌是我國常見的惡性腫瘤之一，其發生發展的分子機制多樣。研究表明，基因突變、等位基因高頻率雜合性缺失(LOH)、抑癌基因失活等均可促進食管癌的發生發展。如DNA聚合酶β(DNA polymerase β，DNA polβ)啟動子發生突變，在食管癌細胞中表達增加[4]。抑癌基因p53所在染色體17p13區域存在LOH，導致表達失活，食管癌發生[5]。

Fig 1　Eca cells express high levels of PLCE1( n=26)

A: The bars indicate the relative mRNA levels of PLCE1 of OE33 and CP-C cells; B1-B2: The expression of PLCE1 protein was detected by Western blot,**P<0.01vsHEK293 cell.

Fig 2　Suppression of PLCE1 induces apoptosis in CP-C cells( n=26)

A: The dot plots indicate the frequency of dead CP-C cells (PI+) and apoptotic cells (Annexin V+); B-C: The bars indicate the summarized data of dead cells (B) and apoptotic cells (C),**P<0.01vsmock.

最近兩項大樣本全基因組關聯研究(GWAS)發現了新的食管癌易感基因位點rs2274223，定位于染色體10q23的PLCE1基因[6-7]。PLCE1是近年發現的磷脂酶C家族的新成員，在細胞信號轉導過程中起重要作用，調節細胞生長、增殖、分化，影響細胞骨架改變、細胞運動、細胞凋亡、腫瘤生長及發展等生物學行為[8-9]。目前有關食管癌中PLCE1表達水平的報道結果不盡一致，Chen 等[10]報道哈薩克族食管癌患者中PLCE1表達升高，其表達水平與腫瘤分期正相關。Hu等[11]則報道食管癌組織中PLCE1 mRNA表達水平下降，免疫染色分析提示基因型rs2274223 GG者 PLCE1染色分數低于AG型。而我們的研究發現PLCE1在食管癌細胞OE33和CP-C中均高表達，與chen的研究結果一致。分析出現這種情況的可能原因有：(1)樣本數有差異；(2)種族差異；(3)環境因素。

表觀遺傳學調控是當今生命科學關注的前沿，在基因調控中起重要作用，其涉及的機制主要包括DNA甲基化、miRNA、組蛋白修飾及染色質重塑等。DNA甲基化是指DNA在甲基轉移酶(DNA methyltransferase，DMT) 的催化下，以s-腺苷甲硫氨酸(SAM)為甲基供體，將甲基轉移到特定的堿基上的過程。在哺乳動物中DNA甲基化主要發生在5′-CpG-3′的C上生成5-甲基胞嘧啶(5mC)。在真核生物中發現了3類DNA甲基轉移酶(Dnmt1、Dnmt2、Dnmt3a、Dnmt3b)。Dnmt1是一種維持性甲基化酶；Dnmt2可與DNA上特異位點結合；Dnmt3a和Dnmt3b是重新甲基化酶，它們使去甲基化的CpG位點重新甲基化，即參與DNA的從頭甲基化。眾多研究發現，在腫瘤發生發展的過程中，DNA甲基化能關閉某些抑癌基因的活性，去甲基化則誘導了癌基因的重新活化和表達[12]。本研究發現，CP-C細胞中甲基化狀態的p53 大于75%，而抑制CP-C細胞中PLCE1的表達后，p53表達上調，p53啟動子甲基化狀態明顯下調，提示抑癌基因p53啟動子高甲基化在食管癌的發生發展中發揮重要作用。

細胞凋亡下調是腫瘤發生的重要原因之一，眾多因子參與細胞凋亡的調控，如TNF-α促進細胞凋亡[13]，GS-459679抑制細胞凋亡[14]，SCO2 (細胞色素C氧化酶2合成物)可誘導p53表達從而促進細胞凋亡[15]。大量研究證實[16]，p53與細胞凋亡密切相關，p53能通過高爾基復合體轉運Fas短暫促進血管平滑肌細胞表面Fas表達并促進Fas-FADD的結合誘導凋亡。腫瘤細胞過表達p53能誘導細胞凋亡，而特異性抑制劑分別抑制caspase-8及caspase-9后均能抑制這種p53依賴的凋亡，表明p53對死亡受體通路和線粒體通路均有影響[17]。通過本研究發現，抑制食管癌細胞中PLCE1的表達可促進p53的表達，進而促進食管癌CP-C細胞凋亡。

綜上所述，我們推測， PLCE1通過促進p53啟動子區甲基化抑制p53 的表達，從而抑制食管癌細胞凋亡。PLCE1可能成為食管癌治療的新靶點。

Fig 3　Inhibition of PLCE1 upregulates expression of p53 in Eca cells( n=26)

A: PLCE1 inhibited expression of p53 mRNA; B1-B2: The levels of p53 protein was detected by Western blot. C1-C2: The Western blot showed the expression of PLCE1 in HEK293 cells. D1-D2: The PLCE1 gene knockdown results. Mock: Untreated group; siRNA: Treated with PLCE1 siRNA. scramble: Treated with control siRNA. HEK293 cells were treated with mock (HEK293a), or pPLCE1 (PLCE1 overexpression plasmid) (HEK293b), or control plasmid (HEK293c).**P<0.01vsmock.

Fig 4PLCE1 induces p53 promoter methylation(n=26)

HEK：HEK293；PLCE1-d: PLCE1 siRNA；csiRNA: Scramble；PLCE1 O-ex: PLCE1 plasmid；M: Methylated primer；U: Un-methylated primer.**P<0.01vsHEK cells

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PLCE1 modulates p53 expression and apoptosis in esophageal cancer cells

LI Yun, ZHANG Jun-hang, AN Jun, HE Jin-yuan, HUANG Shao-hong

(DeptofCardiothoracicSurgery,theThirdAffiliatedHospitalofSunYat-senUniversity,Guangzhou510630,China)

Key words: esophageal cancer; phospholipase cepsilon 1; p53; apoptosis; small interfering RNA; epigenomics