甘遂與甘草合用對甘遂毒性成分甘遂萜酯A、甘遂萜酯B代謝的影響

網絡出版時間：2014-12-4 13:45網絡出版地址：http://www.cnki.net/kcms/doi/10.3969/j.issn.1001-1978.2015.01.029.html

◇復方藥物藥理學◇

甘遂與甘草合用對甘遂毒性成分甘遂萜酯A、甘遂萜酯B代謝的影響

景欣悅1，彭蘊茹2，王新敏3，段金廒3

(1.南京中醫藥大學第二臨床醫學院，江蘇 南京210023；2.江蘇省中醫藥研究院，江蘇 南京210028；3. 南京中醫藥大學江蘇省方劑高技術研究重點實驗室，江蘇 南京210023)

中國圖書分類號：R-332；R282.71；R284.1；R285.5；R345.99；R977.3

摘要：目的研究甘遂與甘草合用對甘遂中毒性成分甘遂萜酯A (Kansuinine A, KA)和甘遂萜酯B (Kansuinine B, KB) 代謝的影響。方法將正常對照組、甘草組、甘遂與甘草合用組大鼠給予相應藥物處理10 d后，制備肝微粒體。將甘遂的毒性成分KA、KB與各組肝微粒體進行體外共孵育，測定孵育后體系中KA、KB的濃度，用于評價KA、KB的代謝情況。另取正常大鼠肝微粒體，分別加入CYP3A4、CYP2D6、CYP2C9、CYP1A2、CYP2C19的抑制劑紅霉素、鹽酸苯海拉明、苯溴馬隆、西咪替丁和氟康唑，與KA、KB進行體外共孵育，檢測孵育后體系中KA、KB的濃度，闡明參與KA、KB代謝的CYP酶亞型。取正常大鼠肝微粒體，分別加入甘草酸與甘草次酸，與KA、KB體外共孵育，測定孵育后體系中KA、KB的濃度，評價甘草酸與甘草次酸對KA、KB代謝的影響。結果甘遂與甘草合用組微粒體中KA、KB的含量明顯高于正常對照組和甘遂組，表明甘遂與甘草合用使甘遂中毒性成分KA、KB的代謝受到抑制。與紅霉素、鹽酸苯海拉明、苯溴馬隆、西咪替丁和氟康唑共孵育的微粒體中KA、KB的含量均明顯高于空白對照組，表明CYP3A4、CYP2D6、CYP2C9、CYP1A2、CYP2C19均參與了KA、KB的代謝。與甘草酸和甘草次酸共孵育，體系中KA、KB的濃度明顯高于空白對照組。CYP3A4、CYP2D6、CYP2C9、CYP1A2表明甘草酸和甘草次酸能夠抑制KA、KB的代謝。結論CYP2C19均可能參與了甘遂毒性成分KA、KB的代謝，甘遂與甘草合用能夠抑制CYP3A4、CYP2D6、CYP2C9、CYP1A2及CYP2C19的活性，而使KA、KB的代謝減慢，產生蓄積；另外，甘草中主要成分甘草酸和甘草次酸能夠抑制KA、KB的代謝，這可能是甘遂與甘草合用毒性增加的原因之一。

關鍵詞：甘遂萜酯A;甘遂萜酯B;CYP2C19;酶抑制劑;甘草酸;甘草次酸

收稿日期:2014-09-02,修回日期:2014-10-08

基金項目：國家重點基礎研究發展計劃(973計劃)資助項目(No 2011CB505300,2011CB505303)；南京中醫藥大學青年自然科學基金(12XZR17)；江蘇省高校自然科學基金(13KJB360006)

作者簡介：景欣悅(1978-)，女，博士，助理研究員，研究方向：藥物代謝，Tel:025-85811234,E-mail：jing_xinyue@163.com;

通訊作者段金廒(1956-)，男，博士，教授，博士生導師，研究方向：中藥復方與中藥資源化學，，E-mail：dja@njutcm.Edu.cn

doi:10.3969/j.issn.1001-1978.2015.01.029

文章編號：

文獻標志碼：A1001-1978(2015)01-0136-05

Abstract:AimTo study the combined effect Euphorbia kansui of and Glycyrrhiza uralensis on metabolism of Kansuinine A and Kansuinine B. MethodsControl, GU and GU plus EK groups were treated for 10 days, respectively. Then the liver microsomes were prepared. KA and KB were incubated with microsomes of each group, and concentrations of KA and KB were measured to reflect the metablism of KA and KB. Erythromycin, diphenhydramine hydrochloride，benzbromarone，cimetidine，fluconazole the inhibitors of CYP3A4, CYP2D6, CYP2C9, CYP1A2, CYP2C19 respectively, were incubated with KA and KB. Concentrations of KA and KB were measured to reveal the cytochrome P450 isoforms which involved in the metabolism of them. KA and KB were incubated with glycyrrhizic acid and enoxolone. Then concentrations of KA and KB were measured to reveal the effects of glycyrrhizic acid and enoxolone to KA and KB. ResultsConcentrations of KA and KB in GU plus EK group were significantly higher than those in control and EK groups, which showed that the metablisom of KA and KB was inhibited in GU plus EK group. In addition, concentrations of KA and KB were higher in microsomes incubated with erythromycin, diphenhydramine hydrochloride, benzbromarone, cimetidine and fluconazole than in control group, which revealed that the metablism of KA and KB was slowed down when CYP3A4, CYP2D6, CYP2C9, CYP1A2 and CYP2C19 were inhibited. They may participate in the metablisom of KA and KB. After incubation with glycyrrhizic acid and enoxolone, the metablism of KA and KB was slowed down. ConclusionsKA and KB may be the substrates of CYP2C19. GU plus EK can inhibit the activity of CYP2C19, which resulted in KA and KB metablism slowing down and accumulation. In addition, glycyrrhizic acid and enoxolone can inhibit the metablism of KA and KB. It may be one of the reasons of increased toxicity of GU plus EK.

甘遂始載于《神農本草經》，言其“味苦寒，主大腹疝瘕，腹滿，面目浮腫，留飲宿食，破癥堅積聚，利水谷道”。現行藥典記載甘遂為大戟科(Euphobiaceae)大戟屬(Euphorbia)植物甘遂(Euphorbiakansui，EK)的干燥塊根，具有瀉水逐飲的功能。用于水腫脹滿、胸腹積水、痰飲積聚、氣逆咳喘、二便不利[1]。毒性研究表明，過量使用易引起腹痛、腹瀉，嚴重時會出現劇烈嘔吐、血壓下降、脫水和呼吸衰竭等癥狀。功效研究表明，甘遂化學成分具有抗癌抗腫瘤活性、抗病毒、抗胰腺炎等作用，亦可影響免疫系統的特異性[2]。

中藥配伍禁忌概括為歌訣“本草名言十八反，半蔞貝蘞及攻烏，藻戟遂芫俱戰草，諸參辛芍叛藜蘆”最早見于金元時期張子和的《儒門事親·卷十四·十八反》。“甘遂反甘草(Glycyrrhiza uralensis，GU)”為中藥配伍禁忌之一，但從古到今，不斷有醫家報道配伍使用后無明顯毒副作用，而實驗研究的結果亦不盡相同[3-4]。后世醫家對其從各個角度進行了的實驗驗證。對大鼠心、肝、腎病理形態影響顯示存在較明顯毒性增強的情況[5]。

目前研究報道，甘遂主要化學成分主要為二萜類和三萜類化合物。活性研究也主要是針對二萜類和三萜類化合物的單體成分進行的。研究表明，二萜類化合物有較強的刺激作用，但也有抗腫瘤活性，提示其毒性成分與有效成分之間有一定的內在聯系。三萜類成分也具有一定的藥理活性，但其毒性方面的研究較少。甘遂本身所含巨大戟萜醇及其衍生物和一些二萜酯類如甘遂萜酯A、甘遂萜酯B均為毒性成分，具有激活EB病毒早期抗原活性、皮膚刺激及促進腫瘤發生作用[6]。所以，甘遂毒性成分的代謝可能影響其毒性作用。甘遂與甘草合用，可能影響了參與甘遂毒性成分代謝的酶，而使甘遂毒性成分代謝減慢，產生蓄積，導致毒性增強。本實驗擬從甘草與甘遂合用對甘遂中毒性成份代謝的影響的角度入手，闡明二者合用增毒的可能原因。

1材料與方法

1.1試劑與儀器

1.1.1儀器Waters Acquity UPLC(美國Waters公司)，XevoTriple四極桿檢測器(美國Waters公司)，配置電噴射離子源(ESI)，自動進樣器，MS/MS檢測器，MassLynx軟件；METTER AL104電子天平(梅特勒—托利多儀器上海有限公司)；XW-80A型漩渦混合器(上海滬西分析儀器廠有限公司)；Milli-Q Gradient A10超純水器(Millipore Inc. USA)；AllegraTM21R Centrifuge臺式離心機(BECKMAN COULTERTM)。

1.1.2試劑甘草水提物，甘遂95%醇提物由南京中醫藥大學江蘇省方劑高技術研究重點實驗室提供。甘遂萜酯A、甘遂萜酯B、甘草酸、甘草次酸由南京中醫藥大學江蘇省方劑高技術研究重點實驗室提供，紅霉素、鹽酸苯海拉明、苯溴馬隆、西咪替丁和氟康唑購于中國藥品檢驗所。

甘遂萜酯A、甘遂萜酯B的配制：精密稱取KA、KB粉末各1 mg，加入200 μL DMSO溶解后，加PBS定容至1 mL。配制成1.0 g·L-1的儲備液。

甘草酸和甘草次酸的配制：精密稱取甘草酸1 mg，加熱水溶解并定容至10 mL，終濃度為100 mg·L-1的應用液，臨用現配，并置于熱水浴中保持溶解性；精密稱取甘草次酸1 mg，加入100 μL乙醇溶解后，加入PBS定容至1 mL濃度為1 g·L-1。紅霉素、鹽酸苯海拉明、苯溴馬隆、西咪替丁和氟康唑的配制：均用PBS配制成1.0 g·L-1的溶液。

1.2實驗動物與分組健康♂ Sprague-Dawley大鼠，體質量180～200 g，由上海西普爾—必凱實驗動物中心提供。自然晝夜環境飼養，給予標準飼料，自由攝食、飲水，室溫保持(22±2)℃，相對濕度為50%～60%。動物實驗由南京中醫藥大學動物倫理委員會批準實施。動物隨機分組3組，分別為正常對照組、甘草組、甘遂與甘草合用組，每組6只。

1.3給藥方法與劑量按組別灌胃給予相應藥物提取物，正常對照組給予0.25%的CMC-Na溶液。甘草組為10 g生藥·kg-1，甘遂與甘草合用組為20 g生藥·kg-1。連續灌胃給予各組提取物10 d，每天1次。于末次給藥8 h后禁食16 h。

1.4肝微粒體的制備采用差速離心法制備肝微粒體[7，8]。動物于末次給藥8 h后開始禁食，禁食16 h后，采用乙醚麻醉各組大鼠，股動脈放血后，頸椎脫臼處死，迅速取下肝組織，置于0～4℃冰板上。將肝組織剪碎，用0.15 mol·L-1KCl-0.1 mol·L-1磷酸鹽緩沖液反復沖洗3次，除去血紅蛋白后加入上述磷酸鹽緩沖液制成肝勻漿，在4℃下以9 000×g離心20 min后，取上清液，于4℃下以100 000×g離心60 min，將粉紅色沉淀物(微粒體)懸浮于含30%甘油的磷酸鹽緩沖液中，使用Bradford法[9]測定試劑盒測定肝微粒體蛋白濃度，分裝后置于-80℃冰箱內保存。

1.5體外孵育法研究甘遂與甘草合用對甘遂中毒性成分KA、KB的影響KA、KB分別與正常對照組大鼠肝微粒體、甘遂處理組肝微粒體和甘草與甘遂合用組肝微粒體共孵育。反應體系中含NADPH再生系統(NADP 500 μmol·L-1, G-6-P 10 mmol·L-1, G-6-P-OH 1 kU·L-1, MgCl20.5 mmol·L-1)，微粒體蛋白終濃度為1 g·L-1。先將反應體系置于37℃水浴預溫孵5 min后，加入KA、KB啟動反應，KA、KB的終濃度均為2.0 mg·L-1。孵育30 min后，加入50 μL乙腈中止反應。反應總體積為200 μL。

1.6CYP3A4、CYP2D6、CYP2C9、CYP1A2、CYP2C19的抑制劑對KA、KB代謝的影響取正常大鼠肝微粒體，反應體系中含微粒體蛋白終濃度為1 g·L-1、NADPH再生系統(NADP 500 μmol·L-1, G-6-P 10 mmol·L-1, G-6-P-OH 1 kU·L-1, MgCl20.5 mmol·L-1)。分別加入CYP3A4、CYP2D6、CYP2C9、CYP1A2、CYP2C19的抑制劑紅霉素、鹽酸苯海拉明、苯溴馬隆、西咪替丁和氟康唑，終濃度均為100 mg·L-1。于37℃預溫孵5 min，加入KA、KB啟動反應，溫孵30 min后，加入50 μL乙腈中止反應。KA、KB的終濃度均為 2.0 mg·L-1。反應總體積為200 μL。

1.7體外孵育法研究甘草酸、甘草次酸對KA、KB代謝的影響取正常大鼠肝微粒體，反應體系中含微粒體蛋白終濃度為1 g·L-1、NADPH再生系統(NADP 500 μmol·L-1, G-6-P 10 mmol·L-1, G-6-P-OH 1 kU·L-1, MgCl20.5 mmol·L-1)。分別加入甘草酸和甘草次酸，于37℃預溫孵5 min，加入KA、KB啟動反應，溫孵30 min后，加入50 μL乙腈中止反應。KA、KB的終濃度均為 2.0 mg·L-1。甘草酸和甘草次酸的終濃度均為10 mg·L-1。反應總體積為200 μL。

1.8色譜條件及MS質譜條件色譜柱為ACQUITY UPLC BEH C18 柱(100 mm×2.1 mm，1.7 μm)；流動相為0.1%甲酸水-乙腈=40 ∶60；流速：0.4 mL·min-1；柱溫：30℃；ESI-MS采用正離子檢測的電噴霧電離方式；KA、KB的錐孔電壓分別為44V和56V；去溶劑化溫度為550℃；去溶劑化氣流為1 000 L·h-1。在該色譜條件下，KA和KB的保留時間分別約為3.909 min和5.932 min (R>1.5)，分離較好，且血漿中的內源性物質不干擾KA、KB的測定。

2結果

2.1甘遂與甘草合用對甘遂中毒性成分KA、KB代謝的影響將甘遂中毒性成分KA、KB分別與正常對照組(Control)、甘遂組(EK)、甘遂與甘草合用組(EK+GU)微粒體體外共孵育，測定孵育后體系中KA、KB的濃度。KA、KB在各組中的濃度見Fig 1。結果顯示，甘遂組微粒體中KA的濃度與正常對照組間差異無顯著性，而甘遂與甘草合用組微粒體中KA的濃度明顯高于正常對照組和甘遂組，表明合用使KA的代謝受到抑制；甘遂組微粒體中KB的濃度高于正常對照組，表明單獨使用甘遂可使KB的代謝減慢，而甘遂與甘草合用組KB的濃度明顯高于正常對照組與甘遂組，表明合用使KB的代謝受到抑制的程度增加。

Fig 1　Concentration of KA (A) and KB (B) in hepatic

Treated rats were prepared as described in Materials and Methods. Data represent the mean ± SD of two different preparations.*P<0.05,**P<0.01vscontrol;#P<0.05,##P<0.01vsEK.

2.2CYP3A4、CYP2D6、CYP2C9、CYP1A2、CYP2C19的抑制劑對KA、KB代謝的影響取正常大鼠肝微粒體，分別加入CYP3A4、CYP2D6、CYP2C9、CYP1A2、CYP2C19的抑制劑紅霉素、鹽酸苯海拉明、苯溴馬隆、西咪替丁和氟康唑，與KA、KB體外共孵育，測定孵育后體系中KA、KB的濃度。孵育后，KA、KB在各組中的濃度見Fig 2。結果顯示，各組微粒體中KA、KB的含量均明顯高于空白對照組，表明CYP3A4、CYP2D6、CYP2C9、CYP1A2、CYP2C19的活性受到抑制，KA、KB的代謝均減慢，CYP3A4、CYP2D6、CYP2C9、CYP1A2、CYP2C19均可能參與了KA、KB的代謝，其中CYP2C9對KA代謝的影響最為明顯，CYP2C19對KB代謝的影響最為明顯。由此可以推測，甘遂與甘草合用抑制了CYP3A4、CYP2D6、CYP2C9、CYP1A2、CYP2C19等酶的活性，從而使甘遂中毒性成分KA、KB的代謝減慢，產生蓄積，最終導致甘遂毒性增加。這可能是甘遂與甘草合用增毒的原因之一。

Fig 2　Concentration of KA (A) and KB (B) in hepatic

Incubation mixture consisted of microsomal protein (1 g·L-1). Treated rats were prepared as described in Materials and Methods. Data represent the mean ± SD of two different preparations.*P<0.05,**P<0.01vscontrol.

2.3甘草酸、甘草次酸對KA、KB代謝的影響取正常大鼠肝微粒體，分別加入甘草酸和甘草次酸與KA、KB共孵育，測定孵育后體系中KA、KB的濃度。KA、KB在各組中的濃度見Fig 3。結果顯示，加入甘草酸和甘草次酸，溫孵體系中KA、KB的濃度明顯高于正常對照組，表明甘草酸和甘草次酸能夠抑制KA、KB的代謝。

Fig 3　Concentration of KA (A) and KB (B) in hepatic

Incubation mixture consisted of microsomal protein (1 g·L-1). Treated rats were prepared as described in Materials and Methods. Data represent the mean ± SD of two different preparations.*P<0.05vscontrol.

3討論

本實驗通過微粒體體外孵育的方法，研究甘遂與甘草合用對甘遂中毒性成分KA、KB代謝的影響，結果表明，甘遂與甘草合用使KA、KB的代謝受到抑制；KA、KB分別與CYP3A4、CYP2D6、CYP2C9、CYP1A2、CYP2C19的抑制劑紅霉素、鹽酸苯海拉明、苯溴馬隆、西咪替丁和氟康唑體外共孵育，測定孵育后體系中KA、KB的濃度，以確定是哪種酶的亞型參與了KA、KB的代謝。結果表明，幾種酶亞型均參與了KA、KB的代謝，以CYP2C9和CYP2C19影響最為明顯。甘遂與甘草合用可能抑制了CYP3A4、CYP2D6、CYP2C9、CYP1A2、CYP2C19當中一種或幾種酶的活性，從而使甘遂中毒性成分KA、KB的代謝減慢，產生蓄積，最終導致甘遂的毒性增加。這可能是甘遂與甘草不能合用的原因之一。

有研究表明，甘遂化學部位GS-3可明顯促進脾淋巴細胞增殖，證明GS-3為甘遂致炎的毒性部位群。用HPLC-MSn色譜技術對GS-3部位進行化學組成分析，結果共鑒定了其中的12個二萜類化合物[10]。為進一步闡明甘遂毒效作用的物質基礎，采用硅膠柱層析和制備液相等多種色譜手段對甘遂毒性部位進行了化學分離。結果共分離鑒定了8個化合物，甘遂萜酯A和甘遂萜酯B為其中兩個。有文獻報導二萜酯類如甘遂萜酯A、甘遂萜酯B均為毒性成分[6]，故我們選擇甘遂萜酯A、甘遂萜酯B為目標化合物，考察甘遂與甘草合用對KA、KB兩個毒性物質代謝的影響，來闡明合用增毒的原因。

“甘草能解百藥毒”、“十方九草”是中醫方劑配伍解毒、調和藥性之經典認識。然而，“十八反”則告誡人們海藻、大戟、甘遂、芫花與甘草相對立不宜伍用。研究表明，“藻戟遂芫俱戰草”致毒、增毒效應可能的作用機制有：(1)諸藥與甘草配伍后其有毒物質可能與甘草中的甘草酸通過氫鍵形成復合物，以及具有表面活性的甘草三萜酸均有助于毒性成分的溶出，使其在水煎劑中的含量增高；(2)甘草在一定條件下或可穩定大戟、甘遂毒性成分二萜醇(酯)和二萜原酸酯類成分的存在狀態，或延緩其毒性成分在體內的消除速率而蓄積增毒。然而，甘草中主要成分甘草酸和甘草次酸對甘遂中毒性成分代謝的影響還未見報道。我們的實驗采用體外微粒體溫孵的方法考察甘草酸和甘草次酸對KA、KB代謝的影響，以從兩味藥單體成分相互作用這一角度闡明合用增毒的可能原因。

當然，中藥成分非常復雜，對中藥有效成分進行細胞色素P450酶多種亞型的研究及藥物相互作用研究還不能夠全面闡釋中藥相互作用的原因。中藥間、中西藥間及中藥各成分間的相互作用尚需通過深入研究其對藥物代謝酶系統的影響規律，進而闡明中藥相互作用、毒副作用發生的分子機制及科學內涵，為中醫藥相互作用機制賦予現代的、科學的解釋，為臨床合理用藥提供理論基礎，提高中藥使用的安全性和有效性[11]。

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Combined effect ofEuphorbiakansuiandGlycyrrhizauralensison

metabolism of Kansuinine A and Kansuinine B

JING Xin-yue1, PENG Yun-ru2, WANG Xin-min3, DUAN Jin-ao3

(1.No.2ClinicalMedicalCollege,NanjingUniversityofChineseMedicine,Nanjing210023,China; 2.JiangsuProvincial

AcademyofTraditionalChineseMedicine,Nanjing210028,China; 3.JiangsuKeyLaboratoryforHighTechnology

ResearchofTCMFormulae,NanjingUniversityofChineseMedicine,Nanjing210023,China)

Key words: Kansuinine A; Kansuinine B;CYP2C19;enzyme inhibitors;glycyrrhizic acid;enoxolone