原發性膽汁性膽管炎患者血清自身抗體及生化指標的特征分析*

周曉冬，劉會利，趙漢東，劉紅莉(西安市第八醫院檢驗科，西安 710061)

原發性膽汁性膽管炎(primary biliary cholangitis，PBC)是由自身免疫介導的膽汁淤積性慢性肝臟疾病，起病隱匿，進展緩慢，可進一步發展為肝硬化、門靜脈高壓、肝衰竭。近年來我國PBC的發病率呈不斷上升趨勢，但目前尚無根治的方法，研究[1]顯示：在疾病早期及時應用熊去氧膽酸(UDCA)等治療能改善血清生化指標及肝組織學病變從而延緩病情進展，晚期則效果甚微，故早發現、早診斷、早治療是控制此病的關鍵。隨著自身抗體的檢測技術的發展，國內外已有大量的關于PBC早期診斷和自身抗體特點的報道，本研究對65例PBC，81例病毒性肝病和50例健康對照組自身抗體的表達差異、生化指標的特征，以及自身抗體與生化指標間相關性的分析，以期總結PBC的實驗室診斷特征，進一步提高對此病的早期認識和鑒別診斷。

1 材料與方法

1.1 研究對象 收集2011年1月～2015年12月在西安市第八醫院初診的 PBC患者64例，其中男性9例，女性55例，年齡37～73歲，平均年齡56.94±8.93歲；病毒性肝病患者81例，男性45例，女性36例，年齡43～75歲，平均年齡54.86±8.72歲，其中乙型肝炎53例，丙型肝炎28例。體檢健康對照者50例，男性32例，女性18例，年齡40～71歲，平均年齡53.23±6.25歲。PBC診斷標準采用2009年美國肝臟病學會推薦的PBC診斷指南：①膽汁淤積的生物化學改變，主要是指無其他原因解釋的堿性磷酸酶(ALP)升高，B超檢查膽道系統正常；②AMA-M2陽性(AMA-M2/抗gp210陽性)；③肝活檢組織檢查，符合PBC改變。符合上述三項之中的二項可診斷為PBC[2]。病毒性肝病患者入選標準采用2004與2005年我國制定的丙型病毒性肝炎與乙型病毒性肝炎防治指南中的診斷標準[3]。

1.2 試劑和儀器 自身抗體選用德國歐蒙醫學實驗診斷股份有限公司的自身抗體譜IgG檢測試劑盒、自身免疫性肝病IgG類抗體檢測試劑盒、EURO Star III Plus熒光顯微鏡、EURO BIot Master II免疫印跡儀；生化指標選用邁瑞全自動BS-800生化分析儀。

1.3 方法

1.3.1 采集空腹靜脈血6 ml，置于2個促凝試管中，分離血清。

1.3.2 間接免疫熒光法(IIF)：自身抗體譜IgG檢測試劑盒包被有4種抗原基質：Hep-2、猴肝、大鼠胃、大鼠腎臟，可檢測抗核抗體(ANA)、抗線粒體抗體(AMA)、抗平滑肌抗體(ASMA)、抗肝腎微粒體抗體(LKM)。按試劑盒說明書操作，熒光顯微鏡觀察細胞或組織內出現特異性綠色熒光，血清稀釋度≥1∶100判為陽性。

1.3.3 免疫印跡法(IBT)：自身免疫性肝病IgG類抗體試劑盒可檢測AMA-M2，M2-3E，抗Sp100抗體、抗PML抗體、抗gp210抗體、抗LKM-1抗體、抗LC-1抗體、抗SLA/LP抗體、Ro52。血清按照1∶100稀釋，按照試劑盒要求操作，用歐蒙公司的計算機程序(EURO Line Scan)自動判讀條帶的陰陽性和著色強度。

1.3.4 全自動生化分析儀檢測血清總膽紅素(TBIL)、丙氨酸氨基轉移酶(ALT)、天冬氨酸氨基轉移酶(AST)、堿性磷酸酶(ALP)、γ-谷氨酰轉移酶(GGT)、總膽固醇(TC)。

2 結果

2.1 三組人群的自身抗體結果 見表1。PBC組ANA和AMA以及其高滴度(≥1∶320)的陽性率

表1 間接免疫熒光法檢測三組人群的自身抗體結果(n，%)

明顯高于病毒肝炎組和健康對照組，差異有統計學意義(P<0.01)；AMSA和LKM三組間兩兩比較，差異均無統計學意義(P>0.05)。PBC組的熒光模型主要表現為胞漿顆粒型59.38%(38/64)，核顆粒型15.63%(10/64)，著絲點型12.50%(8/64)，核點型3.13%(2/64)，核膜型1.56%(1/64)，核仁型1.56%(1/64)。病毒性肝炎組無特征性核型。2.2 三組人群的自身免疫肝病抗體結果 見表2。PBC患者中AMA-M2，M2-3E，sp100，gp210，Ro52五種抗體與病毒性肝炎組及健康對照組比較，差異均有統計學意義(P<0.01)；其余PML，SLA/LP，LC-1，LKM-1三組之間比較差異均無統計學意義(P>0.05)；健康對照組均未檢出肝抗原抗體。

表2 免疫印跡法檢測三組人群的自身免疫肝病抗體檢測結果(n%)

2.3 三組人群的生化指標結果 見表3。PBC組和病毒性肝炎組患者血清中TBIL，ALT，AST，ALP，GGT，TC都有不同程度的升高，除PBC組和病毒性肝炎組ALT的比較、病毒性肝炎組和健康對照組TC的比較差異無統計學意義(P>0.05)，其余三組間兩兩比較差異均有統計學意義(P<0.05)。

2.4 PBC組自身抗體與生化指標的相關性 見表4。PBC組中，僅抗gp210抗體陽性和陰性兩組間TC的差異有統計學意義(P<0.05)，其余包括AMA-M2陽性和陰性兩組的生化指標之間比較，差異均無統計學意義(P>0.05)。

表3 三組人群的生化指標結果

注：a.PBC組與病毒性肝炎組相比，P<0.05；b.PBC組與健康對照組相比，P<0.05；c.病毒性肝炎與健康對照組相比，P<0.05；d.PBC組與病毒性肝炎組相比P>0.05；e.病毒性肝炎組與健康對照組相比，P>0.05。

表4 PBC組中AMA-M2陰/陽性組、gp210陰/陽性組生化指標的比較

3 討論

原發性膽汁性膽管炎(PBC)是自身免疫性肝病常見的一種疾病，患者血清可檢測出與肝臟疾病相關的高滴度的自身免疫性抗體，主要累及中年女性，男女比例為1∶(9～10)，中位發病年齡為50歲左右。何麗芬[4，5]等研究都報道PBC患者血清中自身抗體的陽性率情況，二者結果有所差異，本研究結果顯示PBC患者以女性為主，男女比例為1∶6.22，平均年齡56.94歲；血清中自身抗體陽性率與前述報道存在差異，如ANA陽性率高出報道[4]22.25%，AMA-M2陽性率高出報道[5]12.83%，Sp100陽性率于兩者報道之間，其余與上述報道基本相符。秦雯等[5]報道PBC患者的熒光核型依次為顆粒型、著絲點型、胞質型；文獻[6]報道，PBC患者常見熒光模型為著絲點型、核膜型和核點型，其中核膜型AMA是PBC的一個特異性血清學指標，有助于PBC的診斷。本研究PBC患者的熒光模型以胞漿顆粒型為主，與上述報道[5，6]不太一致。以上報道中PBC患者自身抗體的陽性率和熒光模型之間有一些差異，可能與實驗方法、試劑、地域以及患者治療階段藥物的影響有關，病毒性肝病患者血清中為無特征性熒光模型的低滴度的自身抗體，而且陽性率明顯低于PBC患者。UDCA是目前美國肝病學會、食品藥品監督管理局(FDA)唯一推薦治療PBC 的藥物，臨床上運用UDCA聯合激素或免疫抑制劑治療，而病毒性肝病主要是干擾素抗病毒治療并提高免疫力治療，若兩者誤診治療方案相反便會加重病情，因此檢測自身抗體和特征性熒光模型對PBC的診斷和鑒別有重要的價值。

AMA是PBC高度特異性的抗體，特異度95%，PBC患者在臨床癥狀、生化和組織學異常表現出現之前，血清中即可出現高滴度的AMA。AMA的靶抗原有M1～M9九個亞型，其中M2是PBC的標志性抗體，敏感度95%～98%，特異度86%～97%[4]。M2-3E是AMA-M2的3個靶抗原的三聯融合蛋白(BPO)，包括丙酮酸脫氫酶復合體E2亞單位(PDC-E2)、支鏈二酮酸脫氫酶復合體E2亞單位(BCOADC-E2)、2-酮戊二酸脫氫酶復合體E2亞單位(OGDC-E2)，這些酶催化酮酸底物氧化脫羧，定位于線粒體內膜。國內文獻報道[7]AMA-M2和M2-3E的陽性率為78.4%和92.2%。國外文獻[8]PBC患者血清中AMA-M2靶抗原的陽性率明顯高于AMA-M2。本研究AMA-M2和M2-3E陽性率比以上報道偏低，但M2-3E陽性率相比AMA-M2高出10.77%，與報道相符。因此，AMA-M2和M2-3E聯合檢測可作為PBC早期診斷重要的免疫學指標，對于無癥狀患者AMA-M2和M2-3E陽性、尤其M2-3E單獨陽性時應高度懷疑PBC，并建議肝組織活檢進一步診斷，以免漏診。

與PBC相關的自身抗體還有抗gp210抗體、抗Sp100抗體和Ro52?？筭p210抗體是核孔復合物中一種完整的膜蛋白抗體，PBC患者中特異度高達99%，敏感度10%～41%[2]，并很少出現在其他的自身免疫疾病中。研究[9]顯示gp210陽性PBC患者易進展為肝衰竭，也有研究表明gp210與PBC患者預后無關[6]；李鳳惠等[10]研究發現gp210陽性主要出現在AMA或AMA-M2陰性患者中，推測血清抗gp210的檢測有助于AMA-M2陰性PBC患者的診斷?？筍p100抗體靶抗原是相對分子質量為100×103的可溶性酸性磷酸化核蛋白，點狀分布于細胞核內，對PBC的診斷特異度達94%[5]，并顯示AMA陰性的PBC患者Sp100陽性率明顯高于AMA陽性患者，且Sp100陽性多出現在疾病晚期和疾病進展較快的PBC中，因此抗Sp100陽性與PBC病情嚴重程度及預后有相關性。唐映梅等[11]檢測PBC患者gp210和Sp100的陽性率分別為26.7%和16.90%。本研究PBC患者中gp210和Spl00陽性率比上述報道高，與研究[6]一致；Sp100在AMA陰性中的陽性率(66.66%)明顯高于AMA陽性中的陽性率(13.46%)，與報道[5，6]相符；但由于積累的AMA陰性病例太少，關于gp210和Sp100對PBC疾病進程和預后的影響研究并不充足。Ro52是一個相對分子質量為52 000的蛋白質以及與其相連的小RNA組成，參與細胞的轉錄調節過程，存在于多種自身免疫性疾病中并特異度較低，是目前已知的抗核糖核蛋白抗體中分布最廣、最常見的一種抗體。本研究顯示PBC組Ro52陽性率比病毒性肝病組高26.66%，其差異表明Ro52也是PBC診斷的一個重要的自身抗體指標。

PBC以慢性非化膿性膽管炎為特征，主要累及小葉間及間隔膽管，以匯管區周圍損害逐漸增多擴展到肝實質損害。病毒性肝炎以肝細胞變性壞死為主，并伴有不同程度的炎性細胞浸潤、肝細胞再生和纖維組織增生。血清ALT和AST主要來源于肝細胞胞漿和肝細胞線粒體；ALP廣泛分布于人體肝臟、骨骼、腸、腎和胎盤等組織經肝臟向膽外排出的一種酶；GGT在肝內主要存在于肝細胞漿和肝內膽管上皮中。因此，肝功能指標的改變在一定程度上與疾病分期及組織學損害嚴重度有關。本研究顯示PBC患者與病毒肝炎患者比較肝細胞的損害無明顯差異，肝內膽管損害和膽汁淤積比較嚴重，其中ALP最高1 592.7U/L，GGT最高2 436.0U/L，TBIL最高443.1 μmol/L；另外，同年齡組病毒性肝炎并不影響患者TC的變化，而PBC患者的TC有明顯升高，最高13.13 mmol/L，說明PBC患者肝臟損害的同時脂代謝也受到一定的影響。UDCA治療PBC后6～9個月內90%的患者肝功能得以改善，但PBC相關的自身抗體特征不會改變[2]。因此，生化指標不僅可用于PBC的鑒別診斷，還可用于疾病分期和療效觀察。

另外，本研究通過對PBC患者中AMA-M2陰性/陽性組、gp210陽性/陰性組生化指標的比較，表明除TC外，自身抗體AMA-M2和gp210與肝臟損害無相關性，與報道[4，12]相符。李虎等[13]最新報道Th9細胞亞群在PBC中的顯著升高與TBIL，ALT，AST，GGT有相關性，并且參與PBC的發生和發展。這提示我們繼續積累病例從新的方向對PBC進行更深入的研究。

綜上所述，PBC患者血清中可檢出多種自身抗體，特異性抗體AMA，AMA-M2，M2-3E，Sp100，gp210在PBC中的表達有一種或幾種同時出現，其中任何一種自身抗體單獨出現都可提示早期PBC；并且結合生化指標可對PBC進行鑒別診斷、病程分期和療效評價。

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