腎癌患者的血清氨基酸含量及其臨床意義

腎癌患者的血清氨基酸含量及其臨床意義

夏韓，熱娜·阿布力孜， 安恒慶， 哈木拉提·吐送， 王文光， 拜合提亞·阿扎提，

木拉提·熱夏提， 張立東， 王玉杰

(新疆醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院泌尿中心， 烏魯木齊830054)

摘要：目的探討腎癌患者術(shù)前血清與健康人血清的氨基酸差異及其臨床意義。方法收集病理確診的腎癌患者140例(病例組)術(shù)前血清及140例健康人(對照組)的血清標本，應(yīng)用高效液相色譜(HPLC)代謝組學法檢測兩組標本中血清游離氨基酸的含量，并進行比較分析。結(jié)果與對照組相比，病例組腎癌患者血清存在明顯的氨基酸代謝異常，其中天冬氨酸、絲氨酸、甘氨酸、組氨酸、精氨酸、蘇氨酸、丙氨酸、脯氨酸、胱氨酸、酪氨酸、纈氨酸、蛋氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸和賴氨酸含量呈明顯下降趨勢，兩組差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。結(jié)論腎癌患者血清氨基酸含量較正常健康人整體下降，此結(jié)果對進一步研究其發(fā)生機理以及臨床特異性標記物的研究有重要意義。

關(guān)鍵詞：腎癌； 氨基酸； 生物學

中圖分類號：R737文獻標識碼：A

doi:10.3969/j.issn.1009-5551.2015.05.003

[收稿日期：2015-02-28]

基金項目：國家自然科學基金(81060210)； 新疆維吾爾自治區(qū)自然科學基金(2010211B22)

作者簡介：馬雙鈺(1990-),男，在讀碩士，研究方向：泌尿系腫瘤。

Serum amino acids content and its clinical significance in kidney cancer patients

XIA Han， Rena Abulizi, AN Hengqing， Hamulati Tusong， Baihetiya Azhati， WANG Wenguang，

Mulati Rexiat， ZHANG Lidong, WANG Yujie

(DepartmentofUrology,TheFirstAffiliatedHospitalofXinjiangMedicalUniversity,

Urumqi830054,China)

Abstract:ObjectiveTo investigate the differences in serum amino acids in the healthy people and patients with renal cell carcinoma (RCC) and to explore the clinical significance. Methods140 samples of serum amino acids in RCC patients and 140 samples of serum amino acids in healthy people were collected and analyzed by the HPLC to detect and compare their content of free amino acids in serum. ResultsCompared with the healthy people in the control group， patients with renal cell carcinoma (RCC) had obvious disturbance of amino acid metabolism in their serum, with obvious decline in the plasma aspartate， the serine， the glycine， the histidine， the arginine, the threonine, the alanine， the proline， the tyrosine， the cystine, the valine， the methionine， the lysine， the isoleucine， the leucine， and the phenylalanine, and the statistical difference was significant (P<0.05). ConclusionThe detection of specific amino acids in patients with kidney cancer was proved significant for the study on cancer development mechanism and its clinical specific biomarkers.

Key words： renal carcinoma； amino acid； biology

在我國泌尿外科惡性腫瘤中，腎癌的發(fā)病率位居第2位，并呈逐年上升趨勢[1]。由于早期腎癌缺乏臨床表現(xiàn)，且目前臨床缺乏關(guān)于腎癌的特異性血清學檢驗標準。因此，尋找腎癌相關(guān)腫瘤標記物成為腎癌研究的重要課題及熱點[2-3]。氨基酸在人體中具有多種生物學功能，同時也是腫瘤細胞賴以生存的必要條件。腎臟在調(diào)節(jié)血清氨基酸以及清除血液中含氮物質(zhì)的過程中起核心作用，而腎小管上皮的主要功能之一就是重吸收原尿中的氨基酸。由于絕大多數(shù)腎癌起源于腎小管細胞，腫瘤能改變腎小管重吸收原尿中氨基酸的能力，從而改變血中氨基酸的含量[4]。此外，腫瘤細胞對于氨基酸的需求大于正常細胞，這可能與腫瘤細胞產(chǎn)生能量及增殖方式的改變有關(guān)(Warburg效應(yīng))[5]。

為探討腎癌患者血清氨基酸含量的改變及其臨床意義，本研究利用高效液相色譜法(high-performance liquid chromatography，HPLC)定量測定腎癌患者的血清氨基酸，并與健康人的測定值進行比較，現(xiàn)報道如下。

1材料與方法

1.1病例選擇選擇2010年9月-2012年8月在新疆醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院住院治療的腎透明細胞癌患者140例(病例組)，平均年齡54.5歲(34～75歲)，男性98例(70%)，女性42例(30%)，漢族77例(55%)，維吾爾族48例(34.3%)，回族8例(5.7%)，哈薩克族5例(3.5%)，其他民族2例(1.5%)，均經(jīng)組織病理診斷證實。選取新疆醫(yī)科大學體檢中心體檢確定的健康志愿者140例(對照組)，平均年齡56歲(32～80歲)，男性95例(68%)，女性45例(32%)，漢族81例(57.9%)，維吾爾族45例(32.1%)，回族7例(5%)，哈薩克族4例(2.9%)，其他民族3例(2.1%)。病例組與對照組的年齡、性別及民族差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05),具有可比性。

1.2樣品制備病例組患者入院后行普食，治療前抽血。兩組均抽取清晨空腹靜脈血。標本抽取后放入4℃冰箱，1 h內(nèi)處理后放入標本庫-80℃冰箱保存。檢測時從-80℃ 冰箱內(nèi)取出樣本后使用微量移液器將每份樣品取出200 μL，加入400 μL乙腈萃取，渦旋30 s,靜置10 min，4℃、12 000 r/min離心15 min，取上清液至EP管中，40℃氮氣吹干，加水200 μL復(fù)溶后，渦旋30 s，使用一次性濾膜過濾后取出10 μL按衍生反應(yīng)要求進行衍生后進樣。

1.3儀器與方法HPLC色譜儀(美國waters e2695 HPLC系統(tǒng)配2475熒光檢測器及軟件工作站), 色譜柱(Inertsil C18 ODS-SP 規(guī)格：5 μm×4.6 mm×250 mm)，渦漩攪拌器(IKA MS 3basic),微量移液器,pH計(Sartorius,PB-10),溶劑過濾裝置,分析天平(Sartorius,BS110S),氮吹儀,離心機(Thermo型號：Multifuge X3R),氮吹儀(HSC-12A HENGAO T﹠D),水浴鍋(DK-S22型，上海精宏實驗有限公司)，Milli-Q(密理博中國有限公司)。乙腈(色譜純)與甲醇(色譜純)(Sigma-Aldrich 試劑公司提供)，17種氨基酸標準品(waters，美國)；AccQ-FlourTM試劑盒(由waters公司提供，包括AQC粉末2A、2B(Reagent Diluent Flammable)和硼酸鹽緩沖液各1瓶，臨用前取2A粉末加入2B,渦旋并55℃加熱溶解后使用。

2結(jié)果

2.1腎癌患者血清氨基酸的色譜分析各氨基酸之間以及氨基酸與血清中的其他代謝物相互干擾較少，各峰分離較好，說明色譜條件可行(圖1)。17種氨基酸均在30 min內(nèi)有效分離，分離時間分別為5.722、7.084、11.508、12.669、12.850、14.671、15.387、16.668、18.516、22.96、23.203、24.34、24.982、27.115、27.584、28.574 min。在HPLC衍生中，亮氨酸與異亮氨酸常常融合，本研究標品衍生在27.115 min時，亮氨酸峰與異亮氨酸峰相融合，故在圖1中表現(xiàn)為14號峰,圖2亦為此種現(xiàn)象。

圖1　衍生后氨基酸標準品

圖2　腎癌患者血清氨基酸色譜圖

注：1～16號峰分別代表的氨基酸為天冬氨酸(Asp)、谷氨酸(Glu)、絲氨酸(Set)、甘氨酸(Cly)、組氨酸(His)、精氨酸(Arg)、蘇氨酸(Thr)、丙氨酸(Ala)、脯氨酸(Pro)、胱氨酸(Cys)、酪氨酸(Tyr)、纈氨酸(Val)、蛋氨酸(Met)、異亮氨酸(Ilu)+亮氨酸(Leu)、苯丙氨酸(Phe)、賴氨酸(Lys)。

2.2兩組血清氨基酸含量比較與對照組相比較，病例組腎癌患者血清氨基酸含量整體呈降低趨勢。其中除谷氨酸外，兩組其他氨基酸的含量差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05),見表1。

表1　健康組與腎癌患者的血清氨基酸濃度(mol/L， ±s)

3討論

氨基酸是生命活動中最基本的物質(zhì)，是生命代謝的物質(zhì)基礎(chǔ)。在腫瘤組織的惡性轉(zhuǎn)化過程中，由于腫瘤細胞動力學的改變，導(dǎo)致機體出現(xiàn)明顯的代謝異常，主要表現(xiàn)在腫瘤組織蛋白質(zhì)的合成增強和氨基酸分解減弱，這可能與腫瘤細胞旺盛生長有關(guān)。腫瘤組織為了滿足自身的快速生長和細胞的無限制增殖需要從血中攝取某些特定氨基酸，進而引起這些氨基酸在血清中的含量降低[6]。同時腎癌的癌細胞可以侵犯正常腎小管上皮細胞，使腎小管重吸收原尿中的氨基酸的能力降低，從而也可能導(dǎo)致氨基酸在血清中含量的進一步降低。

本研究結(jié)果表明，腎癌患者血清中的氨基酸水平與健康人相比，存在明顯的代謝異常。大部分氨基酸(天冬氨酸、絲氨酸、甘氨酸、組氨酸、精氨酸、蘇氨酸、丙氨酸、脯氨酸、酪氨酸、纈氨酸、蛋氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、賴氨酸)含量明顯降低。這些氨基酸中有統(tǒng)計學意義的多為人體必需氨基酸、支鏈氨基酸及生糖氨基酸，其中以組氨酸降低最為明顯，而這些氨基酸常常也在腎功能衰竭時降低，這與鄒忠梅等[7]的報道相一致。

支鏈氨基酸(branched chain acids，BCAA)包括亮氨酸、纈氨酸、異亮氨酸。亮氨酸和異亮氨酸作為氮的載體不僅在機體蛋白質(zhì)的合成和分解中發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)作用，而且具有提供底物和其他氨基酸合成肌蛋白調(diào)節(jié)劑的能力，同時也是維持機體氮平衡的關(guān)鍵因素。纈氨酸高攝取是腫瘤細胞氨基酸代謝特征之一。本實驗證明，腫瘤組織和細胞中纈氨酸代謝旺盛，腫瘤患者血清中BCAA濃度低于健康對照組。因此在腫瘤生長過程中，可利用支鏈氨基酸作為能源，在三羧酸循環(huán)中獲得更多能量[8-9]。

有研究報道，腫瘤細胞生長不但依賴于總氮水平，而且也依賴于一定量的谷氨酸和天冬氨酸，而且某些腫瘤細胞生長與脯氨酸和苯丙氨酸呈正相關(guān)；而絲氮酸和甘氨酸與腫瘤生長呈負相關(guān)[10]。這提示與腫瘤生長呈正相關(guān)的氨基酸在高水平下可能刺激腫瘤生長，而與腫瘤生長呈負相關(guān)的氨基酸可能為腫瘤細胞所需求。但在個別不同腫瘤中結(jié)論不一致，可能與腫瘤生長部位、腫瘤分級有關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)腎癌患者血清中可抑制腫瘤生長的氨基酸含量減少，而且?guī)追N為腫瘤細胞生長所需的氨基酸亦減少，提示腫瘤細胞可能選擇性地從血中選擇氨基酸，以此滿足快速生長的需求，從而導(dǎo)致機體氨基酸的含量降低。

本研究發(fā)現(xiàn)健康人與腎癌患者血清氨基酸含量存在明顯差異，可為差異氨基酸及臨床標記物的下一步研究提供參考。高效液相色譜技術(shù)具有操作方便、費時少和標本利用率高等優(yōu)點，能為下一步的研究提供物質(zhì)基礎(chǔ)。

腎癌患者血清氨基酸總體水平的降低可能與腫瘤細胞代謝的改變以及腎小管重吸收氨基酸能力的降低有關(guān)。但兩者在血清氨基酸降低的總趨勢中起到的具體作用，仍需要進一步研究。

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(本文編輯張巧蓮)

通信作者：王玉杰，男，教授，主任醫(yī)師，博生生導(dǎo)師，研究方向：泌尿系腫瘤，E-mail:wangyj-mr@vip.sina.com。