不同濃度DMSO對Min6胰島細胞活力和ROS產生的影響

不同濃度DMSO對Min6胰島細胞活力和ROS產生的影響

張紅1， 張麗2， 張燕3， 張之4

(新疆醫科大學1附屬中醫醫院藥學部;2基礎醫學院組織胚胎學教研室, 烏魯木齊830011;

3蘭州軍區烏魯木齊總醫院， 烏魯木齊830000;4新疆醫科大學基礎醫學院藥理學教研室， 烏魯木齊830011)

摘要:目的觀察不同濃度二甲基亞砜(DMSO)對Min6胰島細胞活力和細胞活性氧族(ROS)產生的影響。方法無菌潔凈環境下培養Min6胰島細胞株，細胞良好生長狀態時，分為正常對照組(DMSO含量為0%)及DMSO各濃度組，用不同濃度DMSO(0.005%、0.012 5%、0.05%、0.125%、0.25%)干預Min6 胰島細胞48 h，采用細胞增殖和毒性檢測試劑盒(Cell Counting Kit-8，CCK8法)檢測細胞活力，采用2′,7′-二氯熒光黃雙乙酸鹽(DCFH-DA)探針法檢測ROS的產生水平。結果與正常對照組比較(不含DMSO),0.005%、0.012 5%、0.05%、0.125%，0.25% DMSO組細胞活力均降低;0.005%、0.012 5%、0.05%、0.125% DMSO組間細胞活力差別不大,0.25%DMSO組細胞活力進一步下降，同時ROS產生明顯增加。結論Min6細胞對DMSO敏感，DMSO濃度水平對細胞活力、ROS水平有一定影響,建議相關實驗時注意各組DMSO 含量本身齊同可比，以免影響結果判斷。

關鍵詞:DMSO; 胰島細胞； 細胞活力； 活性氧族

中圖分類號：R33文獻標識碼：A

doi:10.3969/j.issn.1009-5551.2015.04.012

[收稿日期：2014-06-25]

基金項目：新疆名醫名方與特色方劑學實驗室開放項目(XJDX0910-2011-8)

作者簡介：孫蕓(1976-)，女，碩士，副教授，研究方向：中藥及其制劑分析與質量控制。

基金項目：新疆維吾爾自治區重點實驗室醫學動物模型研究實驗室開放課題(XJDX1103-2012-10)

作者簡介：魏琴(1980-)，女，在讀碩士，實驗師，研究方向：免疫學。

The effects of DMSO on cell viability and reactive oxygen species

production in Min6 islet cell

ZHANG Hong1, ZHANG Li2, ZHANG Yan3, ZHANG Yanzhi4

(1DepartmentofPharmacy,TraditionalChineseMedicineHospital,2DepartmentofHistoembryology,

XinjiangMedicalUniversity,Urumqi830011,China;3UrumqiGeneralHospitalofLanzhou

MilitaryAreaCommand,Urumqi830000,China;4DepartmentofPharmacology,

XinjiangMedicalUniversity,Urumqi830011,China)

Abstract:ObjectiveTo observe the effects of dimethyl sulfoxide on Min6 islet cell viability and Reactive Oxygen Species Production (ROS). MethodsMin6 islet cell was cultured under sterile clean environment condition, then interfered by DMSO of different concentration, Cell Counting Kit-8 was adopted to detect the cell viability, DCFH-DA probe was used to detect the Production of ROS. ResultsCompared with 0% DMSO group , Min6 cell viability decreased in group containing DMSO 0.005%， 0.0125%， 0.05%， 0.125%， 0.25%, there was little difference of cell viability between groups containing 0.005%， 0.0125%， 0.05%， 0.125% DMSO. Cell viability decreased further in 0.25% DMSO group,at the the same time ROS production increased. ConclusionMin6 cell sensitive to DMSO,different concentration of DMSO may have different influence on cell viability and intracellular ROS level. it is suggested that to keep the same concentration of DMSO in different group or wrong conclusion may be get.

Key words: DMSO; Islet cell; Cell Viability; Reactive Oxygen Species

糖尿病已經成為21世紀的流行病[1]，胰島細胞是在細胞水平對相關藥物作用進行研究的有力工具，二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide,DMSO)是細胞凍存的保護劑[2]，也是活細胞培養實驗中常用的試藥溶解劑，但不同濃度DMSO本身對培養的細胞會產生截然不同的影響，因此可能成為影響實驗結果的重要因素之一。本課題組在培養Min6胰島細胞進行相關實驗時遇到類似問題，但DMSO本身對胰島細胞的影響鮮有文獻報道。為了幫助排除實驗干擾，本研究探討不同濃度DMSO對培養的Min6胰島細胞活力和細胞活性氧族(ROS)的影響，旨在為相關領域實驗提供一定的參考依據。

1材料與方法

1.1主要試藥及儀器Min6胰島細胞株(ATCC)由中南大學劉峰教授惠贈,二甲基亞砜、四甲基偶氮唑藍(Sigma aldrich公司),DMEM培養基、胎牛血清、β-巰基乙醇、胰蛋白酶(Gibico by Life Technology),Cell Counting Kit(Yeasen ),活性氧族(reactive oxygen species，ROS)檢測試劑盒(碧云天),超凈工作臺(中國蘇州凈化設備公司),CO2細胞培養箱(美國 INNOVA 公司),全自動酶標儀(美國 Bio-RAD 公司),HAIR低溫冰箱(Hair公司),超純水機(美國Millipore),高壓蒸汽滅菌器(上海申安醫療器械廠)。

1.2實驗方法

1.2.1細胞培養及傳代Min6小鼠胰島細胞用DMEM 培養基(含15%胎牛血清、100 U/mL青霉素和 100 μg/mL鏈霉素、1 μL/mLβ-巰基乙醇)，37℃、5%CO2恒溫培養箱中培養[3-4]，隔夜更換培養液，之后2～3 d換液。細胞生長至底面覆蓋率約達到70%時，棄培養基,用PBS洗滌1次，每皿加入 1 mL胰酶消化液，消化4～5 min，顯微鏡下觀察，發現胞質回縮、細胞間隙增大后，立即終止消化。然后加入DMEM 培養基 4 mL終止消化，用移液器反復輕輕吹打使細胞團分散成均勻細胞混懸液，分皿培養。

1.2.2分組及DMSO干預細胞狀態良好時分為正常對照組(既DMSO含量0%組)及DMSO各濃度組，分別為0.005%、0.0125%、0.05%、0.125%、0.25%濃度組，各組干預時間均為48 h。

1.2.3胰島細胞活力測定培養良好的胰島細胞鋪96孔培養板，過夜更換培養液后，按上述濃度進行干預，每組設3個復孔，并設不含細胞只含培養液的空白調零孔。干預48 h后,采用CCK8法檢測細胞活力[5-6], 在電子耦合試劑存在的情況下，WST-8 可以被線粒體內的脫氫酶還原生成高度水溶性的橙黃色的甲臜產物，顏色的深淺間接反映活細胞數量，與細胞的增殖活力成正比，與細胞毒性成反比，在450 nm波長處測定其光吸收值。

1.2.4細胞活性氧族水平測定各組干預完成后，給各組細胞裝載20 μM DCFH-DA(2′,7′-二氯熒光黃雙乙酸鹽)探針，繼續在 CO2培養箱 37℃孵育30 min后盡快洗滌細胞降低背景，在激發波長488 nm左右處檢測DCFH氧化物-DCF發出的綠色熒光，測定細胞內ROS水平[7-9]。

2結果

2.1Min6胰島細胞的一般情況顯微鏡下可以觀察到，用胰酶消化液消化的胰島細胞，胞質回縮，細胞間隙增大，成類圓形，見圖1；分皿培養后Min6細胞貼壁生長，呈多角、類瓦塊狀，融合聚集生長，見圖2。

圖1　剛消化的Min6胰島細胞

圖2　生長融合的Min6胰島細胞

2.2細胞活力測定結果與正常對照組比較(含0%DMSO)，0.005%、0.0125%、0.05%、0.125%、0.25% DMSO組細胞活力均明顯下降(P<0.01，P<0.05)；與0.005% DMSO組比較，0.0125%、0.05%、0.125%DMSO組細胞活力未見明顯差別，而0.25%DMSO組細胞活力明顯下降(P<0.05)，顯示不同濃度DMSO對細胞活力有不同影響,見表1、圖3。

組別DMSO濃度/%細胞活力/%ROS正常對照組0 1007.97±0.440.005%DMSO組0.00586.1±0.06#7.48±0.350.0125%DMSO組0.012581.5±2.69#6.45±0.30#*0.05%DMSO組0.0581.3±3.16#5.67±0.27#*0.125%DMSO組0.12581.5±2.69#5.42±0.03#*0.25%DMSO組0.2578.8±0.70#*6.55±0.19#*△

注：與正常對照組比較，#P<0.05； 與0.005% DMSO組比較，*P<0.05； 與0.125% DMSO組比較，△P<0.05。

圖3　不同濃度DMSO對Min6胰島細胞活力的影響

2.3細胞ROS水平測定結果與正常對照組比較，0.0125%、0.05%、0.125%、0.25%DMSO組細胞內ROS的產生下降(P<0.01)；與0.005%DMSO組比較，0.0125%、0.05%、0.125%、0.25%DMSO組ROS產生減少(P<0.01)；與0.125% DMSO組比較，0.25%DMSO組細胞內ROS產生增加(P<0.01)，見表1、圖4 。

圖4　不同濃度DMSO對Min6胰島細胞內ROS產生的影響

3討論

DMSO作為重要的藥物溶解劑用于細胞培養實驗，但不同細胞對DMSO的敏感性差異甚大，如研究報道DMSO終濃度<2%時對PC12細胞活力無影響,但濃度>4%時有明顯細胞毒性[10]。而對于小鼠骨髓基質細胞(BMSC)，DMSO濃度為0.5%～1.0%時就有明顯的生長抑制作用[11]。可見DMSO對不同細胞的影響濃度差異很大，不能從其對一種細胞的影響結果推及另一種細胞。

國外相關文獻報道胰島細胞常用的DMSO終濃度一般不超過0.2%[12-13]，但原因不詳。本實驗研究顯示，0.005%濃度的DMSO就可能對Min6胰島細胞產生明顯影響，與不含DMSO的培養組比較，含DMSO各濃度組的細胞活力均有降低(DMSO濃度組范圍0.005%～0.25%),DMSO濃度<0.125%的各組之間(0.005%、0.012 5%、0.05%、0.125% )細胞活力維持在一個相對穩定的平臺，各組間細胞活力相差不大，而濃度> 0.125%時0.25% DMSO組細胞活力進一步下降，同時細胞內ROS水平產生明顯增加，說明Min6胰島細胞對DMSO很敏感，這與胰島細胞內還原系統相對弱、易受到氧化應激損傷的特點是相對應的，而0.1%～0.2% DMSO濃度可能是影響胰島細胞活力的重要轉折點。

最近甚至有研究表明DMSO本身有一定抗炎、清除ROS、抑制自發性糖尿病等作用[14],因此在實驗中應當充分重視DMSO溶劑本身的作用，建議相關實驗中最好保持各組DMSO含量齊同可比，以免影響實驗結果的正確判斷。

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(本文編輯楊晨晨)

通信作者：安冬青，女，教授，博士生導師，研究方向：心血管疾病的中醫藥診治，E-mail: andongqing3@gmail.com。

通信作者：丁劍冰，女，博士，教授，博士生導師，研究方向：感染免疫，E-mail：djbing002@ sina.com。