基因芯片快速檢驗細菌的臨床應用

許俊鋼

【摘要】 目的 應用基因芯片對臨床常見致病細菌進行檢測。方法 選取4種臨床常見的致病細菌， 包括金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、沙門氏菌、志賀氏菌， 應用VereFoodborne Detection chip 芯片對所選細菌進行檢測。結果 對臨床30份標本進行檢測， 均得到準確的檢測結果。全部細菌檢測均在8 h內完成， 較臨床常規檢測方法平均縮短1/3時間， 其中部分血液感染標本檢測時間更是從原來的3～5 d縮短至1 d完成， 檢測效率大大提高。結論 基因芯片檢測系統能準確、快速地對目的細菌做出檢測， 是細菌快速檢測的發展方向。

【關鍵詞】 基因芯片；致病菌；檢測

DOI：10.14163/j.cnki.11-5547/r.2016.01.020

金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、沙門氏菌、志賀氏菌是臨床常見的致病菌。針對臨床常見的細菌感染， 目前臨床多采用常規培養方法進行細菌檢測。隨著分子生物學的發展， PCR、熒光定量PCR等方法紛紛引入臨床微生物檢驗中[1]， 不同于傳統的培養方法， 分子診斷技術在保證準確性的同時， 有較強的特異性， 能夠更快速地提供檢測結果。本研究應用成熟的基因芯片檢測系統， 為基因芯片在臨床微生物檢驗中的應用奠定了一定的基礎。現報告如下。

1 材料與方法

1. 1 材料 金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、沙門氏菌、志賀氏菌為鄭州大學附屬洛陽中心醫院檢驗科細菌室培養法確定菌株（共30份）。其中血液標本16份， 痰標本6份， 糞便標本8份， 提取細菌DNA后應用VereFoodborne Detection chip 芯片進行檢驗。

1. 2 糞便細菌DNA的抽提 采用DNA提取試劑盒“QIAamp DNA Mini Kit”， 嚴格按照說明書進行操作提取細菌DNA。

1. 3 細菌DNA的提取與PCR擴增 選擇煮沸法提取細菌DNA， 大致方法是取1 ml無菌生理鹽水落于1～2個血瓊脂平板上過夜培養， 溫度設置為37℃， 連續培養12 h， 加入50 μl DNA裂解液高溫煮沸10～15 min， 然后離心（12000 rpm）5 min， 抽取長清液冷藏于-20℃下。對提取的細菌DNA樣本進行PCR擴增， 擴增體系為50 μl， 94℃初變性30 s， 52℃退火45 s， 72℃延伸60 s， 95℃10 min。前后共35個循環， 72℃延伸8 min。

1. 4 探針的設計 本研究涉及的全部菌株均進行測序對比驗證。參考有關研究， 基于革蘭陽性菌和陰性菌的通用檢測探針， 將標記為Cy3的20 T探針作為陽性探針， 稀釋液作為陰性對照點布于芯片周圍。

1. 5 芯片制備 探針取上海生工生物技術有限公司， 采用Arrayit-SpotBot 3點樣儀點樣， 每個檢測位點平行點樣3次， 點完后室溫避光放置12 h（或置60℃烤箱中固定2 h）， 并固定于NC膜上。

1. 6 細菌DNA的芯片檢測 細菌DNA抽提后應用意法半導體公司Veredus 快速偵檢系統對細菌DNA進行檢測。

2 結果

對30份標本進行檢測， 其結果與目標細菌一致。全部細菌檢測均在8 h內完成， 較臨床常規檢測方法平均縮短1/3時間， 其中部分血液感染標本檢測時間更是從原來的3～5 d縮短至1 d完成， 檢測效率大大提高， 這有助于為及時搶救、治療贏得時間。

3 討論

基因芯片（gene chip）又稱DNA微陣列（microarray）， 是由大量DNA或寡核苷酸探針密集排列所形成的探針陣列， 其基本原理是通過雜交檢測信息。基因芯片是分子生物學和微電子學及信息學相互結合所形成的新型技術， 利用基因芯片， 可以實現基因信息的大規模檢測[2-4]。基因芯片技術是以基因序列為分析對象的生物芯片， 是技術最成熟， 且已實現商用的芯片檢測技術。該技術的核心是集成處理， 即將探針集成于同一基片上， 通過檢測雜交信號以實現對巨量基因信息的檢測分析， 而其具體工作原理是通過在載體上按特定布陣固定分子探針， 以PCR和分子雜交為基礎實現對目的基因的快速、有效地檢測， 這樣不僅顯著提高了檢測結果的準確性， 還大大提高了檢測效率， 尤其是在感染性疾病的高發以及復雜性加劇的背景下， 微生物快速檢測的強度和難度也越來越大， 單單依賴于細菌分離培養已遠遠無法滿足臨床的需求， 而基因芯片技術具有的檢測高效、范圍廣等優點， 使其在病原菌快速檢測領域的優勢越來越突出， 隨之在基因序列分析、抗感染藥物研制等上下關聯領域也有著越發廣闊的應用前景[5]。

本研究結果顯示， 全部細菌檢測均在8 h內完成， 較臨床常規檢測方法平均縮短1/3時間， 其中部分血液感染標本檢測時間更是從原來的3～5 d縮短至1 d完成， 檢測效率大大提高， 這有助于為及時搶救、治療贏得時間。

基因芯片技術經過20年的發展已經形成了一個系統的平臺， 從樣品制備、芯片制作、芯片雜交、數據掃描到后期的數據管理、儲存以及深度數據挖掘都有了標準化的流程。目前商業化的基因芯片， 芯片設計上探針與待檢測的目標序列片段互補， 具有完全的互補性；從而既有較高的敏感性， 也有較高的特異性， 僅對特定目標序列片段敏感， 對其他序列不產生雜交信號， 通過探針設計， 提高基因芯片檢測的容錯性、可靠性， 在基因芯片上設置質量監控探針， 以便于監控基因芯片產品的質量穩定性；通過探針布局， 使得最終的雜交檢測圖像便于觀察理解[6]， 質量穩定性好， 可重復性強。

從本研究結果來看， 基于基因芯片技術的快速檢測系統檢測結果與目標細菌一致， 說明檢測準確率令人滿意。實際上， 隨著基因芯片技術的進一步發展， 諸如玻璃芯片、液相芯片、模芯片等模式正在大大豐富基因芯片在細菌檢測中的應用范圍。不過， 基因芯片技術檢測細菌也存在一定的局限， 如無法精確地提供涉及細菌毒力、耐藥等信息， 且受細菌雜交影響大。不過， 隨著分子生物學、半導體微電子技術等基因技術相關學科的發展， 更為綜合性和標準化的基因芯片技術開始出現， 如利用多重PCR與芯片技術相結合的DNA芯片， 可同時檢測8種生物恐怖相關的病原菌， 且精確率高， 大大提高了檢測效率。此外， 本研究過程中還發現基因芯片在檢測掃描結束后， 其呈現的熒光信號強度隨著時間的延長而出現一定的衰減， 而背景信號強度則逐漸增強。不過， 時間延長至60 d觀察， 信號強度受SNR值影響微小， 判斷結果基本不受干擾， 從這個角度上說， 檢測完畢后芯片可實現長期的留存， 便于復檢。不過， 許多新的技術仍處于試驗階段， 相信未來隨著基因芯片技術的進一步成熟， 其應用范圍將擴展到微生物診斷、環境監測、生物危害防治等領域， 大大拓寬基因芯片技術的邊界。

參考文獻

[1] Muldrew KL. Molecular diagnostics of infectious diseases. Curr Opin Pediatr， 2009， 21（1）：102-111.

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[3] Chee M， Yang R， Hubbel E， et al. Accessing genetic information with high-density DNA array. Science， 1996， 274（5287）：610-614.

[4] Marshall A， Hodgson J. DNA chip： an array of possibilities. Nat Biotechnol， 1998， 16（1）：27-31.

[5] 張春秀， 肖華勝 .基因芯片技術的發展和應用. 生物產業技術， 2010， 3（5）：75-80.

[6] 孫嘯， 王曄， 何農躍， 等 .生物信息學在基因芯片中的應用.生物物理學報， 2001， 17（1）：27-33.

[收稿日期：2015-07-10]