銀杏酮酯對缺血性卒中患者血漿促炎因子及認知功能的作用研究

程弘禹，張新江，李姍姍，劉斌，邵淵，徐運，張梅娟

缺血性卒中的高發病率、高致殘率、高病死率給社會和家庭帶來沉重的負擔[1-2]。缺血性卒中也是導致血管性認知功能損害的重要原因，研究顯示，17%～92%的卒中患者會出現輕度認知功能損害[3]。腦缺血后腦免疫炎癥反應在腦缺血損傷及血管性癡呆形成的病理生理機制中具有重要作用[4]。

銀杏葉提取物是一種來自于銀杏葉中的植物藥。黃酮類和萜類內酯為銀杏葉提取物的主要有效成分，其在抗氧化、改善腦血流、保護心腦血管等方面具有重要的作用[5-7]，在抑制炎癥反應方面，也有相關基礎研究的報道。2005年，Jiao等[8]研究發現銀杏葉提取物可顯著降低動脈粥樣硬化大鼠腦組織中炎癥因子白細胞介素（interleukin，IL）1β和腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF-α）的信使核糖核酸及蛋白水平，提高抗炎因子IL-10及其受體的水平；隨后，有動物實驗報道銀杏酮酯可以降低大鼠海馬組織IL-1β和TNF-α的水平[9-10]。本研究組前期多中心大樣本臨床研究結果顯示，在急性缺血性卒中患者中，銀杏酮酯分散片聯合阿司匹林治療組短期的神經功能、180 d認知功能均顯著優于單用阿司匹林治療組。本文的目的是研究銀杏酮酯保護缺血性卒中的機制是否與調控外周炎癥反應有關。目前尚未見與這一研究相關的報道。

1 對象與方法

本研究采用前瞻性、多中心臨床隨機對照試驗方法。

1.1 研究對象 2012年10月-2014年6月在南京鼓樓醫院和揚州市第一人民醫院神經內科住院的急性缺血性卒中患者。計劃共入組60例，其中試驗組和對照組各30例，由電腦編號并隨機抽取。

入選標準：①年齡在18～80歲；②發病7 d之內，臨床及影像診斷為急性缺血性卒中[11]；③急性卒中治療低分子肝素試驗（Trial of Org 10 172 In Acute Stroke Treatment，TOAST）分型為大動脈粥樣硬化性卒中；④入組時美國國立衛生研究院卒中量表（National Institutes of Health Stroke Scale，NIHSS）評分為4～20分；⑤首次發病，或既往有缺血性卒中病史，但本次發病前NIHSS評分＜4分；⑥根據病情，患者需要接受抗血小板聚集藥物治療；⑦意識清晰，且無全身嚴重并發癥；⑧患者及家屬知情同意，并簽署知情同意書。

排除標準：①妊娠或哺乳期；②神經影像學檢查發現顱內出血者；③既往有自發性顱內出血或蛛網膜下腔出血病史者；④缺血性卒中類型為非大動脈粥樣硬化性；⑤存在對抗血小板聚集藥物治療禁忌證者；⑥合并有嚴重的心、肺、肝、腎功能不全者；⑦合并有嚴重的精神疾患；⑧合并有重要臟器感染，或其他嚴重全身感染者，或傳染性疾病；⑨難以控制的高血壓，即經過正規降壓治療后，血壓仍≥180/110 mmHg者；⑩自身免疫病，近期大手術病史，腫瘤等相關疾病。

1.2 分組及藥物治療方案 分成試驗組和對照組兩組，入組患者按1∶1等量隨機分配至試驗組30例、對照組30例。

給藥方案：試驗組：銀杏酮酯分散片聯合阿司匹林治療，用法為銀杏酮酯分散片，口服，每日3次，每次0.15 g；阿司匹林腸溶片，口服，每日1次，每次0.1 g。對照組僅服用阿司匹林腸溶片，每日1次，每次0.1 g。兩組均連續用藥180 d。

合并用藥：伴有高血壓、糖尿病、高脂血癥的患者根據病情應用相關降壓、降糖、調脂藥物。禁用藥物：腦保護劑尼莫地平、吡拉西坦、奧拉西坦（因此類藥物可能會影響前期認知功能評分試驗），凝血酶抑制劑阿加曲班（因同抗血小板聚集藥物合用可能會增加出血概率），其他銀杏葉制劑等。

1.3 炎癥因子的檢測方法 用藥前、用藥后（13±1）d分別抽取患者空腹靜脈血，離心留取上清液，保存于-80℃冰箱。血清炎癥因子IL-1β、IL-6、IL-15、IL-17A、IL-23、TNF-α的檢測采用人輔助性T細胞（T helper cells，Th17）MAG-14K-06（Millipore）試劑盒，儀器為Milliplex多功能液相芯片儀（MAGPIX12158001，默克密理博公司）；分析軟件：Milliplex Analyst.V5.1軟件。

1.4 神經功能缺損評估 在治療前及治療后（13±1）d、（30±7）d、（90±7）d、（180±7）d分別完成神經功能及認知功能量表評分。采用的量表包括NIHSS評分、改良Rankin量表（modified Rankin Scale，mRS）評分（mRS≤2定義為預后良好）評估近期和遠期卒中后神經功能缺損；簡易精神狀態量表（Minimetal State Examination，MMSE）、蒙特利爾認知評估量表（Montreal Cognitive Assessment，MOCA）評估認知水平。

1.5 統計學處理 所有統計分析均采用SPSS 19.0統計分析軟件，計量資料符合正態分布，以）來表示，其中組間比較采用獨立樣本t檢驗，組內比較采用配對t檢驗。計數資料用率表示，采用χ2檢驗。所有假設檢驗均采用雙側檢驗，以P＜0.05認為有統計學意義。

2 結果

2.1 一般資料和臨床特征 研究計劃共入組60例，其中試驗組和對照組各30例，因采集的血清標本出現溶血而剔除8例，其中試驗組3例，對照組5例，脫落率為13.33%，故最終納入統計分析的試驗組27例，對照組25例。

兩組患者用藥前性別、年齡、既往卒中病史、NIHSS評分、血壓、肝腎功能、凝血四項、血糖、血脂等基線資料，以及血清炎癥因子IL-1β、IL-6、IL-15、IL-17A、IL-23、TNF-α指標的比較均無顯著差異（表1）。

2.2 兩組用藥后有效性比較 兩組受試者在各隨訪時間點的NIHSS評分和mRS評分未見顯著差異（表2）。

實驗組和對照組各時間點MMSE、MOCA評分缺失情況：實驗組用藥前、（13±1）d、（30±7）d脫落2例，（90±7）d、（180±7）d脫落1例；對照組用藥前、（13±1）d、（30±7）d、（90±7）d各脫落1例。

用藥后（30±7）d、（90±7）d、（180±7）d與用藥前MMSE相比，試驗組比對照組改善更明顯（表3）；而MOCA評分在對照組和實驗組之間無顯著差異（表4）。

表1 兩組患者基線資料及用藥前血清炎癥因子指標的比較結果

表2 銀杏酮酯治療組與對照組各時間點的NIHSS評分

表3 銀杏酮酯治療組和對照組各時間點的MMSE評分

表4 銀杏酮酯治療組和對照組各時間點MOCA評分

2.3 兩組各隨訪點血清炎癥因子比較 治療后（13±1）d試驗組血清IL-1β、IL-6、IL-15、IL-17A、IL-23、TNF-α分別為（1.55±0.43）pg/ml、（5.57±4.96）pg/ml、（1.88±0.82）pg/ml、（5.15±1.51）pg/ml、（0.42±0.88）pg/ml和（15.12±6.97）pg/ml，均較治療前顯著下降，P值分別為＜0.001、P＜0.001、0.042、＜0.001、＜0.001和0.009。對照組治療（13±1）d血清IL-1β、IL-15、IL-6、IL-17A、IL-23、TNF-α分別為（1.60±0.32）pg/ml、（4.89±4.20）pg/ml、（2.01±0.72）pg/ml、（5.57±1.33）pg/ml、（0.32±0.20）pg/ml和（17.48±9.15）pg/ml，其中IL-15較治療前顯著下降（P=0.036），其余炎性因子較治療前均無顯著差異。

3 討論

本研究發現，銀杏酮酯分散片聯合阿司匹林治療能顯著降低缺血性卒中后患者血清中IL-1β、IL-15、IL-17A、IL-23的表達水平。表明在其他用藥方案一致的前提下，試驗組加用銀杏酮酯分散片可顯著降低血清炎癥因子的水平，提示銀杏酮酯分散片具有明顯的抑炎作用。本實驗首次在卒中患者中證實了銀杏酮酯分散片能降低人血清Th17分泌的炎癥因子IL-1β、IL-15、IL-17A和IL-23的水平，這為以后銀杏酮酯在炎癥機制方面的研究開辟了新的思路。

銀杏酮酯分散片有效成分為：銀杏內酯B＞2.5%，游離黃酮＞20%，萜類內酯＞10%，總黃酮＞44%。近年來，銀杏葉提取物在腦血管疾病中的研究頗多，如銀杏葉提取物可通過抑制缺血性卒中后的炎癥反應，促進卒中后神經修復和再生，以減少腦梗死體積，保護受到缺血損傷的神經組織和細胞[12-16]，但這些研究基本都局限在動物實驗領域，臨床研究尚未廣泛開展。我們前期試驗通過一系列評分完成了第五代銀杏葉提取物（銀杏酮酯分散片）對改善急性缺血性卒中患者神經功能及其預后、認知執行功能的研究，證實了銀杏酮酯分散片在臨床上治療缺血性卒中的有效性和安全性。本次試驗，我們用Milliplex Map多重檢測技術來首次檢測急性缺血性卒中患者通過銀杏酮酯分散片治療短期內血清多種炎癥因子的濃度，進而從炎癥反應角度上為銀杏酮酯在臨床上治療缺血性卒中炎性損傷提供了證據。

Th17細胞作為輔助性T細胞家族中的獨立于Th1和Th2細胞亞群，最早于2005年由Park等人和Harrington等人發現并命名[17-18]，Th17細胞主要是根據其產生的效應因子IL-17A來定義，除此之外，Th17細胞還產生IL-17F、IL-21、IL-22及粒細胞-巨噬細胞刺激因子（granulocyte-macrophage colony stimulating factor，GM-CSF）等炎性因子[19]。在卒中后，IL-17A同其受體的結合則觸發細胞內信號的發生，該信號即誘導促炎因子如IL-1β、IL-6、CXC趨化因子（CXC chemokines，如CXCL8、CXCL9、CXCL10、CXCL11）、TNF等炎癥因子，從而促進炎癥反應[20-21]。臨床研究中發現，在卒中事件發生的早期，外周血中IL-17、IL-1β的表達水平明顯增高，且與卒中的嚴重程度密切相關[22]。在卒中的動物模型中，本課題組之前的研究顯示缺血1 d后腦組織中IL-17的核糖核酸水平明顯增高，IL-17水平的增高可以持續到缺血再灌注后的6 d[23-24]，而阻斷IL-17所介導的炎癥反應能減輕缺血性腦損傷[25]。同時，有證據表明在癡呆患者血清中IL-17和IL-6高于正常人的水平，提示IL-17可能在癡呆的發生和發展中也具有重要的價值[26-28]。本研究發現銀杏酮酯可以降低急性缺血性卒中患者血清的IL-17和IL-6水平，提示銀杏酮酯可能通過抑制上述炎癥途徑來保護患者的認知功能。

本組研究未顯示銀杏酮酯對神經功能評分有明顯的改善，可能與樣本量小有關。本實驗亦存在許多不足之處：比如缺少年齡相仿的健康成年人的對照；同時，本研究是隨機分組，但并不是雙盲試驗，所以在臨床患者的評分方面不能完全排除主觀性。因此，需要更大規模的臨床試驗來進一步驗證。

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【點睛】通過銀杏酮酯分散片聯合阿司匹林與單用阿司匹林的對照研究顯示，聯合用藥可以降低急性缺血性卒中患者急性期體內炎性介質（白細胞介素和腫瘤壞死因子）的水平，另外聯合用藥組較單藥組的認知功能有改善趨勢。