LC-MS/MS法同時測定CUMS大鼠血漿中3種單胺類神經遞質

臧雨馨，孫冰婷，趙文珠，容　納，戴國梁，居文政，談恒山

(南京中醫藥大學1.藥學院、 2.附屬醫院臨床藥理科，江蘇 南京　210029; 3.南京軍區總醫院臨床藥理科，江蘇 南京　210002)

LC-MS/MS法同時測定CUMS大鼠血漿中3種單胺類神經遞質

臧雨馨1，孫冰婷1，趙文珠1，容納1，戴國梁1，居文政2，談恒山3

(南京中醫藥大學1.藥學院、 2.附屬醫院臨床藥理科，江蘇 南京210029; 3.南京軍區總醫院臨床藥理科，江蘇 南京210002)

中國圖書分類號：R-332；R347；R446.11；R749.42; R977.1

摘要:目的建立測定大鼠血漿中五羥色胺(5-HT)、多巴胺(DA)、去甲腎上腺素(NE)的LC-MS/MS方法，觀察慢性不可預見性溫和應激(chronic unpredictable mild stress，CUMS)抑郁大鼠血漿單胺類神經遞質DA、5-HT、NE的變化情況。方法♂ SD大鼠22只，分為對照組(n=10)和模型組(n=12)，模型組每天給予9種慢性不可預見性溫和刺激因子，造模21 d后，分別于造模前后進行行為學測定及眼眶采血；采用苯甲酰氯作為柱前衍生化試劑，將3種待測物及內標衍生化后進入LC-MS/MS檢測，測定造模前后血漿中5-HT、NE、DA 3種神經遞質濃度。結果造模21d后，與對照組相比，模型組大鼠體重明顯降低(P<0.05)，水平得分、垂直得分均明顯降低(P<0.01)，同時糖水消耗量明顯降低(P<0.01)。血漿中5-HT、NE、DA的濃度在1.47~752、1.75~898、2.05~1053 μg·L-1范圍內線性關系良好，最低定量限分別為1.47、 1.75、 2.05 μg·L-1, 以質控樣品計算，在各濃度水平下，此法的回收率均大于70 %，日內和日間精密度小于15 %，符合生物樣品分析要求。造模21 d后，模型組血漿中5-HT、NE、DA的濃度分別為(3.99±1.21)、(6.24±1.94)、(6.07±1.98) μg·L-1，與對照組相比均明顯降低(P<0.01)。結論CUMS造模成功后，血漿中的3種神經遞質分別呈下降趨勢。

關鍵詞：LC-MS/MS; CUMS; 大鼠; 血漿; 5-HT; DA; NE; 衍生化

抑郁癥(depression)是一種情感障礙性精神疾病，以明顯而持久的心境低落為主要特征，常伴有焦慮、軀體不適感、睡眠障礙、食欲及性欲減退等癥狀[1]。抑郁癥發病機制較為復雜，是與應激密切相關的一類精神疾病，單胺遞質假說認為其發生可能與腦內單胺類神經遞質功能失衡有關。近年來，此假說得到證實，去甲腎上腺素(NE)、五羥色胺(5-HT)、多巴胺(DA)被認為是與抑郁癥的發生關系最為密切的單胺類神經遞質。抑郁狀態可導致中樞神經系統組織形態結構、神經遞質及其受體功能產生明顯改變[2-5]。我們采用慢性不可預見性溫和應激(chronic unpredictable mild stress，CUMS)模型作為實驗動物模型[6]，該模型是迄今為止較為理想的抑郁動物模型，很好地模擬了慢性不可預見性刺激誘發抑郁的過程及生理生化改變[7],行為學及代謝組學研究均顯示CUMS造模較為成功。為了提升此類強極性神經遞質在LC-MS / MS測定中的靈敏度和分離效率，本文采用柱前衍生化結合LC-MS / MS首次同時測定CUMS模型下大鼠血漿中的3種單胺類神經遞質。

1材料與方法

1.1藥品與試劑對照品鹽酸五羥色胺、鹽酸多巴胺均購自Sigma公司(批號分別為：1001528057、101280875)；重酒石酸去甲腎上腺素、內標咖啡酸均購自中國藥品生物制品檢定所(批號分別為：100169-201103、110885-200102)；苯甲酰氯購自成都科龍化工試劑廠(批號為：20120529,分析純，98%)；甲醇、乙腈為色譜純，甲酸、乙酸銨等均為分析純，實驗用水為超純水。

1.2儀器Waters Quattro Micro液質聯用儀(美國Waters公司)，色譜工作站：Masslynx4.1；梅特勒-托利多AE240電子天平(上海梅特勒-托利多有限公司)；Thermo Micro 17冷凍高速離心機(美國Thermo公司)；Millipore Driet-Q5超純水機(法國Millipore公司)；WH-2微型旋渦混合儀(上海滬西分析儀器廠)；離心濃縮儀(美國Labconco公司)；游泳缸，自制敞箱；-80℃冰箱(海爾公司)。

1.3動物及造模方法SD大鼠22只，♂，體質量(200±20)g，由南京中醫藥大學實驗動物中心提供，合格證號：scxk-(蘇)2014-0001。將大鼠隨機分為對照組(10只)和模型組(12只)，對照組5只/籠飼養，模型組每只單籠飼養，正常飲食、飲水。適應3 d后，開始實驗。采用Katz法造模，使大鼠在21 d內接受以下9種刺激因子：① 潮濕墊料和傾斜45°；② 禁食24 h；③ 熱刺激45℃環境(5 min)；④ 夾尾(用塑料夾子夾住距大鼠尾尖1 cm處，持續5 min后取下夾子)；⑤ 4℃冰水游泳(5 min)；⑥ 束縛應激6 h；⑦ 禁水24 h；⑧ 觸摸陌生異常物品(塑料杯、木勺、碎布片等)；⑨ 晝夜顛倒24 h(于早9 ∶00時將大鼠的籠子蓋上黑色塑料袋，不開燈使大鼠處于黑暗狀態；至晚21 ∶00時將籠子上的黑色塑料袋去掉，置于開燈的房間，使動物處于光照狀態，直至次日早9 ∶00時)。每日給予一種刺激，每種刺激累計使用2~3次，順序隨機，使動物不能預料刺激的發生，持續3周。造模前、后分別于大鼠眼眶靜脈叢取血0.5 mL，置于肝素鈉浸泡過的1.5 mL EP管，取血時間前后須一致，3 000 r·min-1離心10 min，取上清液置于干凈的EP管中，整個過程避光，并置于-80 ℃冰箱保存待測。

1.4行為學測定兩組分別于造模前及造模21 d后進行行為學測定，包括體重變化、曠場實驗、糖水消耗實驗。

1.4.1體重變化CUMS抑郁模型動物可出現食欲不振、體重降低等現象，因此體重變化可作為衡量模型動物抑郁程度的標準之一。

1.4.2曠場實驗將大鼠放入高40 cm，長寬均為50 cm，內壁涂黑，底面平均分為25個10 cm × 10 cm的小方格的箱內底面中心，同時進行攝像和計時，以5 min內大鼠穿越箱底面的方格數為水平得分(三爪以上跨入)，穿越一格得1分；以雙前肢抬起次數為垂直得分(兩前肢離地1 cm以上)，雙前肢離地一次得1分。

1.4.3糖水消耗d 1 : 給予每只大鼠兩瓶1%蔗糖水，每瓶各200 mL；d 2: 給予每只大鼠一瓶裝有1%蔗糖水，另一瓶裝有純凈水，每瓶各200 mL；d 3 : 所有大鼠均禁食禁水；d 4: 給予每只大鼠一瓶1%蔗糖水，另一瓶純凈水，每瓶各200 mL，24 h后，取走兩瓶并測量瓶中剩余液體體積，計算動物的糖水消耗量。

1.5血樣處理取血漿100 μL,加入內標20 μL(咖啡酸：5 mg·L-1),加入200 μL乙腈，渦旋5 min,12 000 r·min-1離心10 min，取上清液200 μL，轉移至干凈EP管中，加入50 μL苯甲酰氯(體積分數為0.02的苯甲酰氯溶解于乙腈溶液中)及50 μL四硼酸鈉緩沖溶液，室溫下渦旋5 min,12 000 r·min-1離心10 min,取200 μL上清液置于進樣小瓶中，進樣量：10 μL。

1.6色譜條件色譜柱：Agilent Zorbax SB-C18(150 mm×2.1 mm, 5 μm)，美國Agilent公司；保護柱：Agilent Zorbax SB-C18(12.5 mm×2.1 mm, 5 μm)，美國Agilent公司；流動相: 0.1 %甲酸水溶液(含2.0 mmol·L-1乙酸銨) ∶乙腈=35 ∶65; 流速：0.2 mL·min-1; 柱溫：35℃。

1.7質譜條件離子化方式為電噴霧(ESI)；多反應離子檢測(MRM); 檢測離子為正離子。5-HT為[M+H]+，母離子→子離子m/z ∶385.0→264.2；NE為[M+H]+，母離子→子離子m/z:482.0→105.0；DA為[M+Na]+，母離子→子離子m/z : 487.8→487.7；咖啡酸(IS)為[M+H]+，母離子→子離子m/z : 406.0→105.0。檢測電壓：3.0 kV；錐孔電壓分別為：40V、30V、50V、30 V；離子源溫度：120℃；脫溶劑溫度：350℃；脫溶劑氣體流速：450 mL·min-1，見Tab 1。

Tab 1　MRM parameters of three analytes and internal standard(IS)

2結果

2.1行為學結果造模21 d后，模型組大鼠食欲減退，活動減少，反應遲鈍，和對照組相比，模型組大鼠體重明顯降低，水平得分、垂直得分、糖水消耗量均明顯降低，見Tab 2。

GroupControlgroupModelgroup0dWeight/g249.5±7.97251.7±8.35Open-field(5min)Horizontal55.4±6.3158.2±8.83Vertical20.0±3.5019.8±3.07Sugarconsumption/mL50.3±6.1151.8±9.4121dWeight/g314.5±16.06252.5±12.52*Open-field(5min)Horizontal49.1±6.0311.0±2.47**Vertical14.8±2.782.3±1.30**Sugarconsumption/mL54.7±8.1414.5±3.23**

*P<0.05，**P<0.01vs21 d control

Fig 1　Representative MRM chromatograms of 5-HT,NE,DA and IS in rat plasma samples

A: Derivatization reagent；B: Reference standards of 5-HT, NE, DA and IS dissolved in methanol；C: Blank plasma；D: Plasma added reference standards of 5-HT,NE,DA and IS. 1: IS；2: DA；3: NE；4: 5-HT

2.2色譜行為在本實驗所采用的LC-MS/MS條件下，5-HT、NE、DA和內標互不干擾，峰形良好，無雜峰干擾，基線平穩，保留時間分別為：3.83、4.42、6.20、4.63 min(Fig 1)。本方法具有良好的特異性和分離度，能準確測定血漿中3種神經遞質的濃度，重現性好。

2.3基質效應考察取EP管數支，分別精密加入376、449、526.5 μg·L-1；94、112、131.5 μg·L-1；1.47、1.75、2.05 μg·L-1的5-HT、NE、DA質控標準溶液20 μL，再分別加入內標溶液(5 mg·L-1)20 μL，50 μL苯甲酰氯(體積分數為0.02的苯甲酰氯溶解于乙腈溶液中)及50 μL四硼酸鈉緩沖液,渦旋5 min，12 000 r·min-1離心10 min，取80 μL進樣分析，記錄峰面積A1。

另按“血樣處理”項下操作空白血漿數管，同上操作，記錄峰面積A2。(A2/A1)×100%即為基質效應ME(%)。5-HE、NE、DA和內標基質效應分別在81.62 %~103.77 %、81.25 %~101.52 %、86.74 %~97.12 %、79.20%。

2.4標準曲線和質控取EP管數支，加入100 μL空白血漿，20 μL的內標標液(5.0 mg·L-1)，分別加入濃度分別為1.47、2.94、11.7、23.5、94、188、376、752 μg·L-1的5-HT標準溶液；1.75、3.5、14、28、112、224.5、449、898 μg·L-1的NE標準溶液；2.05、4.1、16.4、32.8、131.5、263.2、526.5、1 053 μg·L-1的DA標準溶液各20 μL，渦旋混勻，配成相應濃度的含藥血漿，0點為空白血漿，按“血樣處理”項下操作。由于空白血漿中本來就有此類內源性物質存在，故測定時要扣除空白血漿所含的量。以各濃度點對0點的差值與內標之比作為標準曲線的縱坐標，血漿藥物濃度為橫坐標。得3條回歸方程，結果見Tab 3。

Tab 3　Standard curves of 5-HT,NE and DA

2.5精密度和準確度考察日內精密度與日間精密度(3 d)。按標準曲線配制方法制備含5-HT、NE、DA濃度分別為376、449、526.5 μg·L-1；94、112、131.5 μg·L-1；1.47、1.75、2.05 μg·L-1含藥血漿質控樣品，按“血樣處理”項下操作，根據隨行標線測得實際濃度。實測濃度的RSD值即為精密度。實測濃度和加入濃度的比值即為準確度，結果見Tab 4。

2.6提取回收率同上操作制備含5-HT、NE、DA分別為376、449、526.5 μg·L-1；94、112、131.5 μg·L-1；1.47、1.75、2.05 μg·L-1的含藥血漿質控樣品，按“血樣處理”項下操作，記錄峰面積A3。提取回收率R%=(A3/A1)×(17/10)×100%，結果如下，5-HT、NE、DA及內標的提取回收率分別為91.91%~106.75%(n=5)、74.34%~83.99%(n=5)、78.85%~86.81%(n=5)、106.54%(n=15)。

2.7穩定性5-HT、NE、DA對照品儲備液和內標溶液室溫放置4 h，與立即測定相同中濃度標準溶液進行比較，以5-HT、NE、DA峰面積分別和內標峰面積的比值折算成實測濃度計算，比值變化在89.72%~103.50%之間；5-HT、NE、DA和內標儲備液在4℃下放置30 d,以實測濃度計算，經與當天新配制的標液進行比較，5-HT、NE、DA和內標儲備液的實測濃度分別為新配制的93.21%、94.36%、91.73%、92.32%，結果表明，5-HT、NE、DA和內標溶液室溫放置4 h和4℃冷藏30 d穩定性良好。

分別考察了5-HT、NE、DA的各高、中、低濃度血漿質控樣品在室溫下放置4 h的穩定性，濃度變化在85.19 %~105.57 %；經血樣處理之后的分析物室溫放置8 h，濃度變化在83.75 % ~110.38 %。24 h后濃度降低了37.40 %~77.50 %；反復凍融3次后，經實測濃度與加入濃度進行比較，濃度變化在91.01 %~109.47 %。結果表明，未處理的血漿樣品室溫下放置4 h內穩定，經血漿處理方法后，8 h內穩定，反復凍融3次均穩定，而血漿處理后樣品室溫放置24 h后有明顯降解，故應當在8 h內完成測定。

2.8樣品測定于造模前和造模21 d后，對模型組和對照組大鼠進行眼眶取血，所得血漿按“血樣處理”項下進行處理測定，與造模21d后的對照組相比，模型組大鼠血漿中5-HT、NE、DA含量均明顯降低。結果見Tab 5。

3討論

本文采用柱前衍生化法首次測定了CUMS模型下血漿中5-HT、NE、DA 3種神經遞質的濃度，方法簡便、專屬性強、準確度高，可作為5-HT、NE、DA血漿含量測定方法。

實驗中，采用最早由Katz提出的慢性不可預見性溫和刺激對大鼠進行為期3周的造模，21 d后對動物進行行為學及糖水消耗實驗，結果表明該造模方法造成的抑郁狀態與臨床上抑郁癥的快感喪失、精神運動衰減等較為相似，該模型很好地模擬了慢性不可預見性刺激誘發抑郁的過程及生理生化改變，與經典的5-HT能神經低下假說相符[8-11]。

5-HT、NE、DA均極性較強，在反相色譜柱上屬于弱保留，且在電噴霧離子化過程中較低的表面活性導致質譜響應較差。為了改善此類高極性化合物的色譜行為，我們采用了柱前化學衍生化的方法以提高靈敏度和分離效率。之所以選擇苯甲酰氯，是因為它可以與伯胺、仲胺等在溫和條件下反應，并且產率較高，同時該試劑廉價易得。

Tab 4　Accuracy and precision of 5-HT,NE and DA

Tab 5Concentration of 5-HT, NE and DA

Group5-HT/μg·L-1NE/μg·L-1DA/μg·L-10dControlgroup(n=10)18.74±3.4686.37±11.5125.37±8.13Modelgroup(n=12)19.74±4.9782.96±12.2423.06±3.2121dControlgroup(n=10)16.95±2.2256.64±8.0519.77±2.21Modelgroup(n=12)3.99±1.21**6.24±1.94**6.07±1.98**

**P<0.01vs21 d control

此外，兒茶酚胺類的不穩定性在儲存和前處理過程中應當引起注意。我們向流動相中加入適量甲酸以阻止其氧化。在相關文獻[12]基礎上，我們改用等度洗脫，調節流動相比例，對液相方法進行了反復優化，在0.1 %的甲酸水溶液中加入2 mmol·L-1乙酸銨后，發現峰形改善，同時比較了50 %、60 %、65 %、70 %、80 %的乙腈比例，選擇了最佳流動相比例65 %的乙腈 ∶35 %的0.1 %甲酸水溶液(含2 mmol·L-1乙酸銨)，使得3種待測物質的保留時間分別為3.83、4.42、6.20 min，將分析時間縮短在8 min內。同時省略了吹干步驟，直接于上清液中進行衍生化，簡化了前處理步驟，使得前處理操作方便快捷。柱前衍生化將待測物5-HT、NE、DA的響應值提升1個數量級，定量下限可達1 μg·L-1。

該方法建立后，CUMS模型組和對照組之間的3種神經遞質的差異性可以被準確定量，對造模成功與否提供實驗依據。

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網絡出版時間：2015-1-9 13:37網絡出版地址：http://www.cnki.net/kcms/doi/10.3969/j.issn.1001-1978.2015.02.025.html

LC-MS/MS method for simultaneous determination of three

monoamine neurotransmitters in rat plasma of CUMS

ZANG Yu-xin1, SUN Bing-ting1, ZHAO Wen-zhu1, RONG Na1, DAI Guo-liang1, JU Wen-zheng2, TAN Heng-shan3

(1.CollegeofPharmacy,NanjingUniversityofTraditionalChineseMedicine,Nanjing210029,China; 2.Deptof

ClinicalPharmacology,AffiliatedHospitalofNanjingUniversityofTraditionalChineseMedicine,Nanjing210029,China;

3.DeptofClinicalPharmacology,GeneralHospitalofNanjingMilitaryAreaCommand,Nanjing210002,China)

Abstract:AimTo establish a LC-MS/MS method for determination of 5-HT, NE, DA and observe the concentration of 5-HT, NE, DA in rat plasma of CUMS. MethodsTwenty-two male SD rats were divided into control group and model group. Model group was given 9 kinds chronic unpredictable mild stimulating factors every day. 21 days later, behavior and orbital blood were measured before and after modeling. Using benzoyl chloride as a pre-column derivatization reagent, three analytes and IS were derivatized before LC-MS/MS detection. Change in three kinds of neurotransmitter concentration was measured in rat plasma before and after modeling. ResultsAfter modeling, compared with control group,the weight of rats in model group was declined significantly(P<0.05). Horizontal scores, vertical scores and sugar consumption were declined significantly(P<0.01). Calibration curves of 5-HT, NE, DA were linear between 1.47~752,1.75~898,2.05~1 053 μg·L-1and LOQ were 1.47, 1.75, 2.046 μg·L-1,respectively. The recovery of 5-HT, NE, DA from plasma was over than 70%, and RSD of inter-day and intra-day assay was limited in 15%．Compared with control group, the concentration of 5-HT, NE, DA in rat plasma of model group was declined to (3.99±1.21), (6.24±1.94), (6.07±1.98) μg·L-1(P<0.01). ConclusionAfter making CUMS model of depression, three kinds of neurotransmitters in rat plasma are decreased.

Key words:LC-MS/MS; CUMS; rats; plasma; 5-HT; DA; NE; derivatization

通訊作者居文政(1965-)，男，博士，主任藥師，博士生導師，研究方向：藥物代謝動力學，，Tel：025-86617141-80518，E-mail：wzhju333@163.com

作者簡介：臧雨馨(1990-)，女，碩士生，研究方向：藥物代謝, E-mail:celloloverzang@126.com;

基金項目：國家科技部“重大新藥創制”科技重大專項(No 2012ZX09303009-002);江蘇省中醫藥領軍人才(No LJ200906)；江蘇高校優學科建設工程資助項目(2010)

收稿日期：2014-10-11, 修回日期：2014-11-11

文獻標志碼：A

文章編號：1001-1978(2015)02-0273-06

doi:10.3969/j.issn.1001-1978.2015.02.025