miR129在胃腺癌中的表達及意義

論著

miR129在胃腺癌中的表達及意義

牟時斌牟云高峰

作者單位： 054900河北省臨西縣人民醫院(牟時斌);河北省民政總醫院(牟云);河北醫科大學第三醫院(高峰)

【摘要】目的探討microRNA129(miR129)在胃管狀腺瘤、胃癌組織及其對應的癌旁組織中的表達及其臨床意義。方法收集經高年資病理醫師確診的55例管狀腺瘤、76例胃腺癌組織及對應的癌旁組織，分別用原位雜交方法檢測miR129的表達，分析miR129表達與臨床病理參數之間的關系。結果癌旁胃黏膜組織中miR-129的表達陽性率高于胃管狀腺瘤組織，胃管狀腺瘤組織中miR-129的表達陽性率高于胃腺癌組織(P<0.05)。miR129在高分化胃癌組織中陽性表達率高于中、低分化組織(P<0.05)；臨床分期Ⅰ期中的陽性表達率高于Ⅲ期;無淋巴結轉移組織中的表達陽性率高于有淋巴結轉移組織(P<0.05)；胃管狀腺癌中miR129陽性率高于彌漫型腺癌(P<0.05)。結論miR129在胃腺癌組織內低表達，發揮著抑癌基因的作用；miR129可作為胃腺癌的判斷預后的標志物。

【關鍵詞】病理學；腺癌；原位雜交；miR-129；抑癌基因

doi:10.3969/j.issn.1002-7386.2015.20.005

【中圖分類號】R 735.2

收稿日期：(2015-03-10)

Expression and clinical significance of miR129 in gastric adenocarcinomaMOUShibin*,MOUYun,GAOFeng.*People’sHospitalofLinxiCounty,Hebei,Linxi054900,China

Abstract【】ObjectiveTo investigate the expression and clinical significance of microRNA129 (miR129) in gastric tubular adenoma tissues,gastric adenocarcinoma tissues and corresponding para-carcinoma tissues.MethodsFifty-five cases of gastric tubular adenoma, 76 cases of gastric adenocarcinoma and corresponding para-carcinoma tissues that were identified by senior pathology doctors were enrolled in the study. The expression levels of miR-129 were detected by in situ hybrization,and the correlation between miR129 expression and clinicopathological parameters was analyzed.ResultsThe positive expression rate of miR-129 in para-carcinoma gastric mucosa tissues was significantly higher than that in gastric tubular adenoma tissues,moreover, which in gastric tubular adenoma tissues was significantly higher than that in gastric adenocarcinoma tissues (P<0.05). The positive expression rate in well differentiated gastric cancer tissues was significantly higher than that in moderately differentiated and poorly differentiated tissues (P<0.05). The positive expression rate of miR-129 in stageⅠcarcinoma tissues was obviously higher than that in stage Ⅲ carcinoma tissues,furthermore, which in carcinoma tissues without lymphonode metastasis was significantly higher than that in carcinoma tissues with lymphonode metastasis (P<0.05). The positive expression rate of miR-129 in gastric tubular adenoma was significantly higher than that in diffuse type adenocarcinoma (P<0.05).ConclusionThe expression levels of miR129 are down-regulated in gastric adenocarcinoma,which may play a role of anti-oncogene,thus miR-129 may be regarded as a marker for evaluating the prognosis of patients with gastric adenocarcinoma.

【Key words】pathology;adenocarcinoma;hybridization in situ;miR-129;anti-oncogene

胃癌是人類常見的惡性腫瘤之一，在國內較為常見，且病死率高。它位居惡性腫瘤死亡的首位,由于胃癌往往沒有特征性的癥狀及體征，許多胃癌患者確診時往往已經處于中晚期[1]，貽誤了最佳治療時機，所以尋找胃癌的標志物是非常必要的。MicroRNA是一類約22個核苷酸組成的非編碼RNA，通過與mRNA的3’URT結合而使其降解或翻譯受阻[2]，進而在轉錄后水平抑制靶基因的表達，研究顯示miRNA在多種人類腫瘤中表達紊亂[3]，并參與腫瘤的發生、發展及轉移[4-6]。

1資料與方法

1.1一般資料收集2005至2013年在臨西縣人民醫院經手術切除的胃癌標本76例，癌腫原發病灶最大直徑2.0～5.0 cm，并選取每個病例中對應的癌旁正常胃黏膜(距離癌灶>5 cm)作為對照，另選取胃黏膜管狀腺瘤標本55例，所選標本均采用甲醛固定，石蠟包埋，按照WHO分級標準分為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ三級，分期采用TNM分期系統分為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ期。所選76例中男40例，女36例；平均年齡48歲。患者性別、年齡、分級、分期，淋巴結轉移情況及Laurens分型是通過復習患者病理記錄底單而獲得。

1.2主要試劑miR129互補(其堿基序列為5’-AAGTGACTGAAACGTAGCCT-3’)探針，poly d(T)陽性對照探針及miR129正義陰性對照探針均購于北京金薩卜生物科技公司，胃蛋白酶K、雜交液及NBT/BCIP顯色液均購于北京中杉金橋公司。

1.3原位雜交(1)貼附有胃癌及癌旁組織的石蠟切片二甲苯脫蠟、梯度酒精水化。(2)用胃蛋白酶室溫消化90～120 s以暴露RNA的核酸片段。(3)切片滴加20 μl預雜交液40℃ 恒溫處理3 h。(4)每張切片滴加20 μl稀釋探針，蓋上蓋玻片42℃雜交過夜。(5)揭掉蓋玻片，室溫下，用SSC洗滌3次，滴加封閉液。(6)滴加生物素化鼠抗地高辛，37℃ 處理1 h，洗滌。(7)滴加SABC 37℃ 處理20 min,0.5 mol/L PBS沖洗。(8)玻片滴加生物素化過氧化物酶37℃ 20 min,PBS沖洗。(9)用NBT/BCIP顯色試劑在玻片上染色。

1.4結果判定標準原位雜交切片以胞漿或胞核內出現黃色或棕黃色顆粒為陽性表達判定標準，每張切片在顯微鏡下隨機選取10個視野，每個視野均計數100個細胞，結合表達情況應用改進的雙評分半定量法評分：陽性細胞數0計為0分，1%～25%計為1分，26%～50%計為2分，51%～75%計為3分，76%～100%計為4分；細胞著色強度:細胞未著色計為0分，淡黃色計為1分，黃棕色計為2分，棕色計為3分。二種計分相乘，得分0～3分作為陰性(-)表達，4～12分計為陽性(+)表達。

1.5統計學分析應用SPSS 15.0統計軟件，計數資料采用χ2檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。

2結果

2.1癌旁胃黏膜、胃管狀腺瘤及原發性胃腺癌中miR-129的表達在癌旁胃黏膜、胃管狀腺瘤及原發性胃腺癌中miR129表達的陽性率為94.7%、83.6%、75.0%，其陽性程度隨著病變程度的加深而減低(P<0.05)，且不同組別之間差異有統計學意義(P<0.05)。見表1，圖1～5。

表1　miR129在不同胃組織中的表達　例(%)

圖1miR129在癌旁胃黏膜中呈強陽性表達(DAB顯色,×200)

圖2miR129在胃腺瘤中呈較強陽性表達(DAB顯色,×200)

2.2胃腺癌中miR129的表達與臨床病理參數之間的關系miR-129在WHO分化Ⅰ級比WHOⅡ級中的表達陽性率高，在WHOⅡ級比WHOⅢ級中陽性率高;miR-129在Ⅰ期中的陽性率比Ⅱ期中高，在Ⅱ期比Ⅲ期高;miR-129在無淋巴結轉移組中的陽性率比有淋巴結轉移組中高；miR129在胃腸型腺癌中的陽性率高于彌漫型腺癌，以上差異均有統計學意義(P<0.05)。不同性別、年齡組患者胃腺癌組織中miR-129的表達差異無統計學意義(P>0.05)。見表2。

圖3miR129在高分化胃腺癌中呈陽性表達(DAB顯色,×400)

圖4miR129在中分化腺癌中呈弱陽性表達(DAB顯色,×400)

圖5miR129在低分化胃腺癌中極弱陽性表達(DAB顯色,×400)

表2　臨床病理參數與miR129表達之間的關系　例(%)

3討論

最近十余年來，越來越多的證據表明miRNA參與了包括癌癥在內的人類疾病的發病過程。據報道，在一些癌癥中存在著miR129的異常表達，并直接涉及了癌癥的發生、浸潤及轉移等過程[7-9]。這些資料提示miR-129在多種癌癥中起著不同的作用，但是對胃癌患者中miR129的表達與胃癌患者預后之間的關系還知之甚少。本研究側重于miR129的表達水平與胃癌各種臨床病理參數之間潛在的關系。由于miRNA在甲醛固定的標本中能得到較好的保存，這就是使其在常規的組織研究中成為富有價值的研究對象[10]。以前的研究多采用RT-PCR方法揭示了miR-129與膠質母細胞瘤的預后較差明顯相關[11]。這些關于miRNA臨床預后的研究都是通過提取癌組織蠟塊中RNA并采用qRT-PCR方法來實現的。癌組織塊中既包含實質性腫瘤細胞，又包含腫瘤相關間質細胞，所以采用從整體癌組織中的RNA提取物進行實驗很可能會產生錯誤的結果。近來資料顯示在腫瘤間質細胞中也存在microRNA的高表達[12]。原位雜交的主要優點是能在細胞水平上精確檢測陽性信號。

經過本次研究，我們發現miR129表達于良性胃黏膜上皮細胞的胞漿之中，在胃癌細胞中的表達則明顯降低；并且miR129的表達隨著胃癌分級、分期的加重及淋巴結轉移的出現而降低；miR-129在腸型腺癌中的表達高于彌漫型腺癌。有研究報道，miR-129在結腸癌[13，14]及肝癌[15]中表達降低，并且miR129的表達降低與結腸癌的臨床分期及演進明顯正相關[13]，這與本研究的結果相一致。有人報道結腸癌中的miR129的表達降低是由于miR-129基因啟動子的高甲基化引起的[15]。最近幾年的研究結果顯示在子宮內膜癌中miR-129的作用的靶標是SOX4基因，由于miR129啟動子的甲基化導致miR-129的表達的降低，從而導致在癌變過程中SOX4的表達升高[16]，類似的結果也見于食管癌及肝細胞肝癌[17，18]。在上述癌癥中SOX4基因的高表達在癌癥演進及轉移過程中起著非常重要的作用[19]。除了SOX4，最近的研究表明在結腸癌中miR-129通過抑制Bcl-2的表達而發揮調節癌細胞凋亡的關鍵作用[20]，miR-129還通過抑制E2F3的表達而影響細胞周期。目前充足的證據表明miR-129的表達缺失與結腸癌，肝癌及胃癌等惡性腫瘤的演進密切相關，所以miR-129能作為胃癌等惡性腫瘤的預后因子。

由于miRNA不但能在甲醛固定石蠟包埋的組織中而且能在細胞外穩定存在，所以可以作為通過抽血而測定的具有可重復性的生物標記物[21]，因此檢測miR-129可能作為胃癌的無創性的重要輔助診斷工具；通過檢測胃液中的miR-129的濃度還能判斷胃癌的預后[22]。

總之，我們的實驗結果顯示miR129在胃癌發生發展中發揮著抑癌基因的作用，miR-129的表達下調預示著胃癌預后較差。miR-129有望成為判斷胃癌預后的重要手段。

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