不穩定型心絞痛患者血液標本保存時間對血漿miRNAs檢測水平的影響

不穩定型心絞痛患者血液標本保存時間對血漿miRNAs檢測水平的影響

李云1,2，宋銀宏2，呂云波1，秦琴1

(1三峽大學人民醫院，湖北宜昌 443000；2三峽大學醫學院)

摘要：目的探討血液標本保存時間對不穩定型心絞痛患者血漿中miRNAs(miRNA-21、miRNA-24、miRNA-126、miRNA-146、miRNA-223)檢測水平的影響，確定其檢測時間窗。方法選取6例接受冠脈造影檢查的不穩定型心絞痛患者，造影時抽取外周動脈血分裝于6支EDTA抗凝管中，每管2 mL；其中3管立即離心分離血漿，4 ℃冰箱保存；余3管全血放入4 ℃冰箱保存。采用實時熒光定量聚合酶鏈反應方法，3管血漿分別于即刻(0 h)、24 h、1周后檢測miRNAs水平，3管全血分別于4、24 h及1周后離心獲得血漿再檢測miRNAs水平，比較各時間段血漿miRNAs水平的差異。結果①與0 h時比較，血液標本即刻離心保存24 h后血漿miRNA-21、miRNA-24、miRNA-126、miRNA-223水平下降(P均<0.05)，1周后血漿5種miRNA水平均明顯下降(P均<0.05)。②與0 h時比較，全血保存4 h后離心分離檢測血漿miRNA-21水平下降(P<0.05)，24 h后血漿5種miRNA水平均下降(P均<0.05)。結論 不穩定型心絞痛患者保存不同時間血漿中miRNAs穩定性不一；其中血漿miRNA-21穩定性最差，需取血后即刻檢測。

關鍵詞：心絞痛，不穩定型；血液標本；保存時間；miRNAs

doi：10.3969/j.issn.1002-266X.2015.41.004

中圖分類號：R541.1;R33

文獻標志碼：A

文章編號：1002-266X(2015)41-0010-03

Abstract:ObjectiveTo investigate the effect of blood-preserving time on the expression of miRNAs (miRNA-21, miRNA-24, miRNA-126, miRNA-146 and miRNA-223 ) in the plasma of patients with unstable angina pectoris (UAP), and to make sure the time window for checking their expression in plasma clinically. MethodsSix UAP patients who accepted coronary angiography were selected as subjects. The peripheral blood (PB) samples of the patients were collected in EDTA anticoagulant tubes and separated into 6 tubes (2 ML in each). During the six tubes, the plasma of 3 tubes were separated, and was preserved at 4℃, the other 3 tubes were preserved at 4 ℃.The levels of miRNAs were detected in the 3 tubes at the moment of centrifugation (0 h), 24 h and one week later by real-time fluorescent quantitative PCR. The same procedures were conducted in the other 3 tubes of whole blood after the plasma was collected. The levels of plasma miRNAs were compared at different time points.Results① The concentrations of miRNA-21, miRNA-24, miRNA-126 and miRNA-223 in plasma were decreased significantly after being stored for 24 h as compared with the moment of 0 h(all P<0.05). The concentrations of all the 5 miRNAs in plasma were decreased significantly after being stored for one week as compared with that of 24 h(P<0.05). ② The concentration of miRNA-21 in plasma was decreased significantly after being stored for 4 hours as compared with that of 0 h(P<0.05)，and the concentrations of 5 miRNAs in plasma were decreased significantly after being stored for 24 h (P<0.05). ConclusionThere are differences among the stabilities of different miRNAs in plasma of UAP patients, and miRNA-21 must be examined immediately owing to its poor stability.

基金項目：三峽大學2013年青年科學基金資助項目(KJ2013A012)。

作者簡介：第一李云(1977-)，女，主治醫師，碩士，研究方向為miRNA與心血管疾病。E-mail：2640217250@qq.com 通信宋銀宏(1972-)，女，副教授，博士，研究生導師，研究方向為腫瘤免疫。E-mail：2646561487@qq.com

收稿日期：(2015-08-03)

Effect of blood-preserving time on expression of miRNAs in plasma

of patients with unstable angina pectoris

LIYun1,SONGYin-hong,LYUYun-bo,QINQin

(1ThePeople′sHospitalofThreeGorgesUniversity,Yichang443000,China)

Key words: angina, unstable; blood specimens; preserving time; miRNAs

目前，許多關于microRNAs(miRNAs)作為臨床疾病診斷標志物的研究，均要求標本2 h內送檢；然而在實際臨床工作中有時難以滿足這一時間要求。為了明確血液標本保存時間對miRNAs檢驗結果的影響，我們分別觀察獲取血液標本立即離心分離血漿后保存不同時間血漿的miRNAs水平以及全血保存不同時間離心分離血漿的miRNAs水平，探討不同檢測時間對血漿miRNAs水平的影響。

1資料與方法

1.1臨床資料選擇 2014年10月～2015年1月宜昌市人民醫院行冠狀動脈(冠脈)造影檢查不穩定型心絞痛患者6例，其中男4例、女2例，年齡(59.7±4.7)歲。入選患者均有典型的不穩定型心絞痛癥狀并冠脈造影檢查陽性(單支主干血管或主要分支病變狹窄≥50%)，并排除急性心肌損傷、急性感染、肝腎功能不全、腫瘤、風濕免疫性疾病及傳染病。患者同意本研究并簽署知情同意書，該研究獲得宜昌市倫理委員會批準。

1.2檢測方法

1.2.1實驗設計冠脈造影時取患者外周動脈血14 mL，分裝6支EDTA抗凝管中，每管2 mL。其中3管立即離心分離血漿，4 ℃冰箱保存；余3管全血放入4 ℃冰箱保存。3管血漿分別于即刻(0 h)、24 h、1周后檢測miRNA水平。3管全血分別于4 h、24 h及1周后離心分離獲得血漿再檢測miRNA水平。

1.2.2血漿miRNAs檢測分離血漿后用 Tiangen公司生產的提取分離試劑盒分離提取血漿RNA并加尾，逆轉錄為cDNA，嚴格按照說明書進行操作。RNA加Poly(A)尾反應體系為：總RNA 10μL、E coli Poly(A) 聚合酶0.4 μL (5 U/μL)、10×Poly(A) 聚合酶緩沖液 2 μL、5×rATP溶液 4 μL、無RNA酶水 3.6 μL；反應條件為37 ℃、60 min；逆轉錄合成cDNA的反應體系為：Poly(A)反應液2 μL、10×RT Primer 2 μL、10×RT 緩沖液 2 μL、超純 dNTPs 1 μL、RNasin 1 μL(40 U/μL)、Quant Rtase 0.5 μL、無RNA酶水11.5 μL；反應條件為37 ℃、60 min。以miRNA-16作為內參[1~3]，用實時定量PCR法檢測不同保存時間血液標本中miRNA-21、miRNA-24、miRNA-126、miRNA-146、miRNA-223表達水平。miRNA-16的上游引物為5′-GATAGCAGCAGGTAAACATTGGCG-3′；miRNA-21的上游引物為5′-CGCCTACCTTATGAGACTGATGTTGAA-3′；miRNA-24的上游引物為5′-TGGCTCAGGTCAG CAGGAACAG-3′；miRNA-126的上游引物為5′-CCTCGTTCCGTGAGTAATAATGCG-3′；miRNA-146的上游引物為5′-CGATGAGAACTGAAATCCTTGGGTTA-3′；miRNA-223的上游引物為5′- TCCTGTCAGTCTGTCAAATACCCCA-3′；下游引物由試劑盒提供。反應條件：94 ℃預變性2 min，主循環為94 ℃變性20 s，60 ℃退火延伸34 s，共45個循環。計算3個復孔平均值作為每個樣本實際 Ct 值，將同一樣本 Ct 值減去其內參 Ct 值，得到ΔCt 值。運用miRNA表達倍數改變值2-ΔΔCt對定量結果進行分析[4，5]，ΔΔCt=ΔCt處理樣本-ΔCt對照樣本，將最后得到的2-ΔCt值進行統計學分析。

1.3統計學方法采用 SPSS19.0 統計軟件。檢測數據以±s表示，不同時間段檢測miRNAs數據比較采用單變量重復測量方差分析。P<0.05 為差異有統計學意義。

2結果

2.1即刻分離血漿后保存不同時間血漿miRNAs水平與0 h時比較，24 h血中miRNA-21、miRNA-24、miRNA-126、miRNA-223水平下降(P均<0.05)，血漿miRNA-146水平改變無統計學意義(P>0.05)；1周后血漿中5種miRNAs水平均明顯下降(P均<0.05)。見表1。

表1　 即刻分離血漿后保存不同時間血漿

miRNAs水平比較( n=6, ± s)

表1　 即刻分離血漿后保存不同時間血漿

檢測時間miRNA-21miRNA-24miRNA-126miRNA-146miRNA-2230h0.301±0.1030.060±0.0230.621±0.4300.090±0.0321.328±1.02324h0.153±0.080*0.025±0.011*0.104±0.085*0.048±0.0210.216±0.101*1周0.002±0.001*0.003±0.001*0.001±0.001*0.002±0.001*0.001±0.001*

注:與0 h相比,*P<0.05。

2.2全血保存不同時間分離血漿miRNAs水平與0 h時比較，4 h離心分離檢測血漿miRNA-21水平下降(P<0.05)，24 h血漿miRNA-24、miRNA-126、miRNA-146、miRNA-223水平下降(P均<0.05)；1周后血漿miRNA-223水平回升，與0 h相比無統計學差異(P>0.05)。見表2。

表2　 全血保存不同時間分離血漿miRNAs

水平比較( n=6, ± s)

表2　 全血保存不同時間分離血漿miRNAs

檢測時間miRNA-21miRNA-24miRNA-126miRNA-146miRNA-2230h0.301±0.1030.060±0.0230.621±0.4300.090±0.0321.328±1.023全血保存 4h0.065±0.012*0.042±0.0130.112±0.0370.063±0.0250.802±0.335 24h0.039±0.017*0.013±0.007*0.073±0.017*0.019±0.010*0.522±0.248* 1周0.027±0.008*0.026±0.012*0.071±0.017*0.008±0.007*1.205±1.098

注：與0 h相比*P<0.05。

3討論

miRNAs是近年來發現的一類高度保守的小分子單鏈RNA，廣泛存在于人體的各種組織，能通過非特異性識別靶基因mRNA3′UTR 區域使 mRNA 降解、抑制或激活，從而調節細胞的多種生物功能。miRNAs的異常與人類多種疾病密切相關，如高血糖可通過下調miRNA-223、miRNA-146a促進動脈粥樣硬化及血栓的形成。急性心肌梗死時血漿中miRNA-208a、miRNA-146、miRNA-1水平明顯增高，并且增高的幅度與心肌梗死面積有關[6,7]，提示miRNAs異常可以引起或預示相應的病理生理改變。研究發現,miRNAs不僅存在于細胞內還能釋放入血，并在血液及體液中穩定存在。已知miRNAs能和微泡、蛋白質、脂蛋白復合體結合抵抗酸堿及核酸酶的破壞并能反復凍融，提示miRNAs可作為一種新的生物標志物[8~10]。

外周血中RNA的穩定性較差，極易被細胞內外的核酸酶降解。而血漿中的miRNAs由于和微泡、蛋白質、脂蛋白復合體結合在一起能抵抗核酸酶及酸堿的破壞，相對較穩定。但是這種結合并非一成不變，而是一個動態的平衡過程。故而血漿標本中的miRNAs隨著時間的推移逐漸被降解。本實驗數據顯示不同的miRNAs的穩定性不一，5種miRNAs中miRNA-21的穩定性較差，考慮與其堿基系列及鍵能較低有關，5種成熟的miRNAs中miRNA-21的CG堿基水平最低。全血保存4 h后血漿中的miRNA-21水平即有明顯改變，因此需及時(2 h內)離心分離檢驗。分離血漿后保存24 h后血漿miRNA-146的水平較0 h無差異，然而全血保存24 h后明顯降低，提示實驗結果誤差與樣本量偏小有關。血漿及全血保存24 h后血漿miRNA-21、miRNA-24、miRNA-126、miRNA-223水平均明顯下降，推測4 ℃miRNAs的血漿保存時間不能超過24 h。同時我們發現分離血漿后保存與全血保存血漿中5種miRNAs水平隨時間延長均為下降趨勢，但全血保存1周后血漿miRNA-223的水平出現明顯回升，提示血細胞能影響血漿miRNAs的水平。已知miRNA-21主要存在于血管平滑肌細胞內，miRNA-24、miRNA-126主要存在于血管內皮細胞內，miRNA-146主要存在于單核淋巴細胞內，而miRNA-223主要存在于血小板內。成熟的miRNAs主要存在于細胞的胞質內，細胞壞死時胞質內的miRNAs釋放入血，導致血漿中的miRNAs水平升高。血管平滑肌細胞的壽命較長，而血小板的壽命較短，大約1周左右,不同細胞的壽命及穩定性不一致導致其對血漿miRNAs水平的影響不一。

冠脈病變及組織缺氧時細胞內miRNA-21、miRNA-24、miRNA-146的表達上調從而調節血管的增殖及新生內膜的形成，同時影響動脈斑塊的穩定性[11～13]。而不穩定型心絞痛的病理學基礎是冠脈的不穩定斑塊，因此miRNA-21、miRNA-24、miRNA-146的水平直接影響不穩定型心絞痛患者的病程及預后。冠脈病變時血漿miRNA-126水平下降，miRNA-126或可作為冠心病血管損傷的生物標志物。miRNA-223富含于血小板中，可作用于受體蛋白相應的mRNAs從而參與血小板黏附、聚集、激活的過程，調節血小板的活化，在血栓性心腦血管疾病發生、發展的病理生理過程中起著非常重要的作用。因此血漿miRNAs的檢測對不穩定型心絞痛患者的診治意義重大。

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