亞低溫狀態下TGF-β 1/Smad2/3通路對大鼠急性腦缺血再灌注損傷的保護作用

亞低溫狀態下TGF-β1/Smad2/3通路對大鼠急性腦缺血再灌注損傷的保護作用

曾洪艷， 彭宇婕，趙曉姝

(昆明醫科大學海源學院,昆明 650000)

摘要：目的探討TGF-β1/Smad2/3通路在亞低溫狀態保護大鼠急性腦缺血再灌注損傷的作用。方法選擇健康成年雄性SD大鼠30只，制作急性腦缺血再灌注損傷大鼠模型，隨機分為假手術組、手術組、亞低溫組各10只。亞低溫組在亞低溫處理1 h后采用干濕法測定各組腦組織含水量，Q-PCR和Western blotting分別檢測各組腦組織TGF-β1和p-Smad2/3的基因和蛋白的表達量。結果亞低溫組腦組織含水量低于假手術組、手術組(P均<0.05)，而TGF-β1和p-Smad2/3的基因和蛋白的表達量高于假手術組、手術組(P均<0.05)。結論 亞低溫能減輕急性腦缺血再灌注損傷引起的急性腦水腫，TGF-β1/Smad2/3信號通路參與了此過程。

關鍵詞：急性腦缺血；再灌注損傷；亞低溫；轉化生長因子β1；Smad2/3；大鼠

doi：10.3969/j.issn.1002-266X.2015.41.009

中圖分類號：R651.1

文獻標志碼：A

文章編號：1002-266X(2015)41-0025-03

收稿日期：(2015-06-04)

急性腦缺血后5～7 min，細胞能量耗盡，引發急性腦水腫，進一步加劇腦缺血，缺血再灌注使一氧化氮和氧自由基的形成增加，加重神經元損傷。急性腦缺血的處理原則是使血管再通，降低腦代謝，控制腦水腫及保護腦細胞等。亞低溫可有效降低腦代謝和控制腦水腫。TGF-β1在急性腦缺血損傷中發揮抗氧化、阻止細胞凋亡、調節炎癥反應，調節小膠質細胞和星形膠質細胞反應等多種作用。目前，TGF-β1/Smad2/3通路在亞低溫保護急性腦缺血再灌注損傷中的作用機制尚不清楚。2014年11月～2015年6月，我們制作動物模型對此問題進行了研究。

1材料與方法

1.1材料健康成年雄性SD大鼠30只，體質量(280±20)g，購自昆明醫科大學動物試驗中心，飼養在清潔級動物室，以標準飼料喂養和飲水。水合氯醛(動物實驗中心提供)，兔抗大鼠TGF-β1單克隆抗體和兔抗大鼠抗p-Smad2/3單克隆抗體(美國Cell Signaling)，TRIzol Reagent(美國Lifetech)，蛋白酶抑制劑(瑞士Roche)，PVDF膜(美國Miliipore)，電子秤(常州市宏衡電子儀器廠)，PCR擴增儀(德國Eppendoff)，熒光定量PCR儀和凝膠數碼成像分析系統(美國BIO-RAD)。

1.2急性腦缺血再灌注損傷模型制備模型制作采用線栓法，以10%水合氯醛(30 mg/kg)腹腔注射麻醉后，將大鼠以仰臥位固定，行頸部正中切口，分別暴露右側頸總動脈、頸內動脈和頸外動脈。手術線結扎頸外動脈近心端，在頸內動脈近心端夾一動脈夾，在頸總動脈距分叉3～4 mm處用眼科剪做一斜行的血管切口，將栓線自血管切口處緩緩插入。栓線通過分叉處后，用手術線扎活結將栓線固定于頸內動脈上，松開頸內動脈處的動脈夾，緩慢將栓線沿右側頸內動脈送至大腦中動脈起始部。起始處深度距頸總動脈血管切口處(20±2)mm，至大腦中動脈遇阻即止，說明栓線已達到大腦中動脈起始部處。阻斷大腦中動脈血流，用手術線扎緊固定栓線，結扎固定栓線。缺血1.5 h后，輕輕外拉尼龍線至頸外動脈內恢復再灌注。

1.3動物分組30只SD大鼠完全隨機分為3組。假手術組10只除不送入栓線外，其余處理皆同大腦中動脈線栓模型手術。手術組10只急性腦缺血再灌注。亞低溫組10只急性腦缺血再灌注后，將冰袋置于大鼠頭頸部，調低空調溫度，在0.5～1 h內使大鼠體溫逐步降低，大鼠肛溫控制在32～34 ℃，持續1 h。其余各組以保持大鼠肛溫為37 ℃左右。

1.4 腦組織含水量測定亞低溫組在亞低溫處理1 h后立即斷頭，各組迅速以冠狀切開大腦，去除額極，雙側大腦各取約2 mm厚的腦組織，采用干濕法測定腦含水量，計算公式為：(腦組織濕重-腦組織干重)/濕重×100%。

1.5 腦組織TGF-β1和p-Smad2/3基因和蛋白表達檢測各組動物處死后取缺血側皮層腦組織，置-80 ℃凍存備用。采用Q-PCR檢測TGF-β1和p-Smad2/3 mRNA，得到目的基因表達的C(t)值，以2-ΔΔCt進行相對定量分析。采用Western blotting檢測TGF-β1和p-Smad2/3蛋白表達，凝膠成像系統掃描圖像，所得圖片用Image J軟件分析灰度值。

1.6統計學方法采用SPSS 17.0統計軟件。計量資料以±s表示，多組數據比較采用單因素方差分析。P<0.05為差異有統計學意義。

2結果

2.1各組腦組織含水量假手術組腦組織含水量為(77.26±12.53)%，手術組為(84.73±11.58)%，亞低溫組為(81.33±14.63)%。與假手術組相比，手術組和亞低溫組腦組織含水量增多(P均<0.05)，亞低溫組與手術組比較，亞低溫組腦組織含水量有所降低(P<0.05)。

2.2各組腦組織TGF-β1和p-Smad2/3基因表達見表1。

表1　各組腦組織TGF-β 1和p-Smad2/3基因表達( ± s)

表1　各組腦組織TGF-β 1和p-Smad2/3基因表達( ± s)

組別nTGF-β1p-Smad2/3假手術組101.24±0.330.72±0.16手術組100.94±0.35*0.44±0.20*亞低溫組101.47±0.32▲0.97±0.34▲

注：與假手術組比較，*P<0.05；與手術組比較，▲P<0.05。

2.3各組腦組織TGF-β1和p-Smad2/3蛋白表達見表2。

表1　各組腦組織TGF-β 1和p-Smad2/3蛋白表達( ± s)

表1　各組腦組織TGF-β 1和p-Smad2/3蛋白表達( ± s)

組別nTGF-β1p-Smad2/3假手術組10126.57±17.95104.68±14.47手術組1083.69±20.63*74.52±16.34*亞低溫組10154.70±23.51▲117.25±20.83▲

注：與假手術組比較，*P<0.05；與手術組比較，▲P<0.05。

3討論

目前，國際醫學界將低溫劃分為輕度低溫(33～35 ℃)、中度低溫(28～32 ℃)、深低溫(17～27 ℃)、超深低溫(16～2 ℃)4種[1]，而28～35 ℃輕中度低溫定義為亞低溫[2]。在低溫狀態下，由于腦代謝和腦耗氧量的下降使腦組織易于改善和維持氧供需平衡，并減少和抑制多種氧自由基及興奮性遞質的合成與釋放，緩解缺血后Na+-K+-ATP酶活性降低而穩定血腦屏障和細胞膜[3，4]，亞低溫治療不但可以減輕顱腦損傷后的病理損害，而且可以促進神經功能恢復[5，6]。亞低溫對腦保護可能的保護機制包括：減少興奮性氨基酸釋放，抑制鈣離子內流，調節鈣調蛋白激酶Ⅱ和蛋白激酶C的活性，抑制腦缺血后的炎性反應，抑制其水腫形成，降低氧代謝率，減少自由基的產生，抑制壞死和線粒體釋放細胞色素C誘導神經元凋亡。亞低溫腦保護作用的機制，可能涉及到損傷級聯中的各個事件，從各個環節影響基因、蛋白質的表達以及轉錄因子的活性。

TGF-β1通過與下游受體型的Smad2/3，使Smad2/3蛋白C端絲氨酸殘基磷酸化[7]，Smad2/3轉位到核內，啟動轉錄因子聚合物LEF/TCF，調控相應基因表達，以此產生廣泛的生物學效應[8]。TGF-β1可由中樞神經系統中神經元、星型膠質細胞和小膠質細胞產生，從而參與調節神經細胞的生長、分化和凋亡，在多種生理病理過程中起著重要的作用[9]。在生理情況下，大腦的很多區域都不表達TGF-β1，但是在缺血缺氧的情況下，其表達卻大幅上調。缺血區TGF-β1表達上調可能的作用有：促血管生成、減弱腦缺血誘發的血管反應、神經保護和抗凋亡。腦室注射TGF-β1能挽救短暫性全腦缺血后海馬CA1區錐體神經元損害，與神經營養因子和纖維生長因子相比，只需1/10 000～1/1 000倍的劑量即可顯示很強的神經保護效應[10]；對體外培養的海馬神經元用TGF-β1進行24 h干預治療，一氧化氮所致的神經毒性可受到明顯抑制[11]。TGF-β1基因敲除的新生小鼠會出現廣泛的神經元變性，這些小鼠的神經元在體外培養時存活時間明顯縮短[12]。此外，TGF-β1可減輕興奮性氧基酸、缺氧/缺血損傷以及β-淀粉樣肽誘導的神經損傷，從而發揮神經保護作用[13，14]。

本研究發現，亞低溫可緩解大鼠急性腦缺血再灌注損傷后急性腦水腫程度，且急性腦缺血再灌注損傷大鼠經亞低溫處理后，損傷腦組織中TGF-β1和p-Smad2/3基因和蛋白表達升高，表明亞低溫可通過激活TGF-β1/ Smad2/3信號通路，減輕急性腦水腫，對急性腦缺血再灌注損傷腦組織起到保護作用。

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