不同宮頸病變組織中TLR4、TLR9及其信號通路下游因子基因的表達變化

不同宮頸病變組織中TLR4、TLR9及其信號通路下游因子基因的表達變化

胡建芳1，季瑩2，余敏敏2

(1淮安市婦幼保健院，江蘇淮安223002；2南京市第二醫院)

摘要：目的觀察不同宮頸病變組織中Toll樣受體(TLR)4、TLR9及其信號通路下游因子NF-κB、IFN-γ基因的表達變化。方法接受婦科手術或宮頸活檢術的患者共90例，根據手術或活檢宮頸組織病理檢查結果分為三組：正常組[高危型人乳頭瘤病毒(HPV)陰性、未見上皮內病變]30例，宮頸上皮內瘤變(CIN)組(HPV陽性、CIN)30例(CINⅠ4例，CINⅡ9例，CINⅢ17例)，宮頸癌組(HPV陽性、宮頸癌)30例(病理分期ⅠA～ⅡA期12例、ⅡB～Ⅳ期18例)。采用實時熒光定量PCR法檢測三組患者宮頸組織中的TLR4、TLR9、NF-κB、IFN-γ基因。結果TLR4、TLR9、NF-κB、IFN-γ基因在三組患者宮頸組織中均有表達，隨著宮頸病變的進展，其表達量均逐漸上升，組間相比，P均<0.05。結論 TLR4、TLR9及其信號通路下游因子NF-κB、IFN-γ基因表達量隨子宮頸病變進展呈上升趨勢，TLR4、TLR9及其信號通路參與并可能促進宮頸癌的發生和發展。

關鍵詞：Toll樣受體；Toll樣受體信號通路；人乳頭瘤病毒；高危型人乳頭瘤病毒；宮頸腫瘤；宮頸上皮內瘤變；宮頸癌

doi：10.3969/j.issn.1002-266X.2015.43.021

中圖分類號：R737.3文獻標志碼：B

基金項目：2014年江蘇省南京市醫學科技發展項目(YKK14154)。

收稿日期：(2015-06-12)

通信作者：余敏敏

高危型人乳頭瘤病毒(HPV)長期和持續感染是宮頸癌的發病原因之一[1]。Toll樣受體(TLR)參與機體先天性免疫，其在癌組織和正常組織中的表達是有差異的[2]。TLR的異常表達引起免疫紊亂可能導致HPV的持續感染，誘導腫瘤免疫微環境的形成，是宮頸癌發生及進展過程中的一個重要環節[3]。本研究對不同宮頸病變組織中TLR4、TLR9及其信號通路下游因子NF-κB、IFN-γ基因的表達變化進行了觀察，探討其在宮頸癌發生、發展過程中的作用，為宮頸癌的早期診斷及免疫治療提供理論依據。

1資料與方法

1.1 臨床資料2013年1月～2014年5月在南京市第二醫院和淮安市婦幼保健院接受婦科手術或宮頸活檢術的患者共90例，年齡23～77歲。手術或活檢宮頸組織病理檢查結果：HPV陰性、未見上皮內病變30例(正常組：為子宮肌瘤或肌腺瘤行全子宮切除術患者)；HPV陽性、宮頸上皮內瘤變(CIN)30例(CIN組：CINⅠ4例，CINⅡ9例，CINⅢ17例)；HPV陽性、宮頸癌30例(宮頸癌組：病理分期ⅠA～ⅡA期12例、ⅡB～Ⅳ期18例)。90例患者術前未接受過化療和放射治療，并具有完整的臨床資料和病理診斷資料，術后留取的宮頸組織標本急速冷凍在-80 ℃冰箱中。

1.2宮頸組織中TLR4、TLR9、NF-κB、IFN-γ基因檢測方法

1.2.1儀器和試劑StepOnePlus實時定量PCR儀、SYBR GREEN PCR Master Mix和TRIzol(美國ABI公司)，RNA反轉錄試劑盒(大連寶生生物工程有限公司)，FRESCO17高速冷凍離心機(美國Thermo公司)，Rios5+Mieei-QB超純水系統(美國Millipore公司)，微量加樣器、組織勻漿機、分光光度計(德國Eppendorf公司)，MDF-38ZE超低溫冰箱、DH6-9143B5-Ⅲ干燥箱(中國上海新苗醫療器械制造有限公司)。

1.2.2引物設計及合成根據GeneBank的數據，采用Primer Premier 5.0軟件設計引物，委托南京銳真生物技術有限公司合成引物。TLR4上游引物為5′-AGACCTGTCCCTGAACCCTAT-3′，下游引物為5′-CGATGGACTTCTAAACCAGCCA-3′；TLR9上游引物為5′-CTGCCTTCCTACCCTGTGAG-3′，下游引物為5′-GGATGCGGTTGGAGGACAA-3′；NF-κB上游引物為5′-AACAGAGAGGATTTCGTTTCCG-3′，下游引物為5′-TTTGACCTGAGGGTAAGACTTCT-3′；IFN-γ上游引物為5′-TCGGTAACTGACTTGAATGTCCA-3′，下游引物為5′-TCGCTTCCCTGTTTTAGCTGC-3′；β-actin上游引物為5′-AGTTGCGTTACACCCTTTC-3′，下游引物為5′-CCTTCACCGTTCCAGTTT-3′。

1.3統計學方法采用SPSS19.0統計軟件。計量資料兩組和多組間的比較分別用雙尾t檢驗和ANOVA方差分析。P<0.05為差異有統計學意義。

2結果

TLR4、TLR9、NF-κB、IFN-γ基因在三組宮頸組織中均有表達，隨著宮頸病變的進展，其表達量均呈逐漸上升趨勢，四者在三組宮頸組織中的表達比較見表1。

表1　三組宮頸組織中TLR4、TLR9、NF-κB、IFN-γ基因的相對表達量比較

注：與正常組相比，*P<0.01，**P<0.05；與CIN組相比，△P<0.01。

宮頸癌組中，12例ⅠA～ⅡA期患者與18例ⅡB～Ⅳ期患者宮頸組織中TLR4、TLR9、NF-κB、IFN-γ基因表達量相比，P均﹥0.05，見表2。

表2　 不同病理分期宮頸癌患者宮頸組織中TLR4、TLR9、

3討論

99%宮頸癌的發生與HPV感染有關[3]。HPV主要通過性接觸傳播。HPV致癌的風險與不同年齡和個體之間的自身免疫能力有著密切聯系，免疫耐受和逃逸可能是HPV持續感染的關鍵[4]。固有免疫是機體抵御感染性疾病的第一道防線。TLR是天然免疫系統模式識別受體家族的重要成員之一，TLR7激動劑咪喹莫特被批準用于治療尖銳濕疣，并已被建議用于治療其他HPV相關性疾病[5]。TLR4可識別細菌的外部成分脂多糖[6]，通過MyD88激活NF-κB、IRF信號通路，導致IL、TNF-α及IFN-γ等細胞因子釋放到胞外，調節宮頸癌細胞的增殖、凋亡及免疫逃逸等。TLR9可以特異性識別病毒DNA中非甲基化的CpG-DNA基序并與其結合，發生二聚化或多聚化，可同時激活細胞毒性T細胞和輔助T細胞，最后激活NF-κB、IRF等轉錄因子，它們可以導致促炎因子的釋放[7]。本觀察發現，宮頸組織中TLR4、TLR9、NF-κB、IFN-γ基因的表達隨著宮頸病變的進展呈逐漸上升趨勢。推測TLR4、TLR9及其信號通路下游因子NF-κB、IFN-γ參與并可能促進HPV感染的免疫調控，與HPV持續感染及宮頸癌的發生、發展有關。ⅠA、ⅡA期與ⅡB、Ⅳ期宮頸癌患者宮頸組織中TLR4、TLR9基因及其信號通路下游因子NF-κB、IFN-γ基因的表達量相比差異無統計學意義，可能與觀察病例數偏少有關；也可能為HPV病毒負荷量逐漸升高，通過與宿主免疫系統的相互作用，過度激活TLR而致Treg和NK受抑制，進而呈現局部免疫功能異常抑制，免疫系統不能正常識別、清除HPV，使HPV感染持續存在，宮頸病變不斷進展[8]。

參考文獻：

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