紅松成熟合子胚愈傷組織誘導的適宜培養條件

紅松成熟合子胚愈傷組織誘導的適宜培養條件

王祎1，趙彤彤1，楊魏1，馬輝1，丁令智1，梁艷2，沈海龍1*

(1.東北林業大學 林學院，哈爾濱 150040；2.齊齊哈爾大學 生命科學與農林學院，黑龍江 齊齊哈爾 161006)

摘要：為了探索以紅松成熟合子胚為外植體誘導愈傷組織的適宜培養條件，以GD、DCR、LM、MS等為基本培養基，以2，4-D和6-BA組成不同濃度激素組合，進行愈傷組織誘導試驗。結果表明，①供試培養基均可誘導紅松成熟合子胚產生愈傷組織，但DCR培養基上誘導的愈傷組織出現最早，出愈率顯著高于其他培養基，達93.3%；②在DCR培養基中添加2，4-D與6-BA的各種組合均獲得了較好的愈傷組織發生，但以2，4-D 2 mg/L+6-BA 0.5 mg/L和2，4-D 6 mg/L+6-BA 1 mg/L的出愈率最高，達96.7%。綜上所述，紅松成熟合子胚外植體誘導愈傷組織時，適宜基本培養基為DCR，適宜激素組合為2，4-D 2 mg/L+6-BA 0.5 mg/L。

關鍵詞：紅松；成熟合子胚；愈傷組織；基本培養基；激素組合

中圖分類號：S 791.247

文獻標識碼：A

文章編號：1001-005X(2015)02-0005-03

Abstract：For the purpose of selecting proper culture conditions of callus induction from mature zygotic embryos of Pinus koraiensis Sieb.Et Zucc.，the callus induction experiment was conducted by using basic media of GD，DCR，LM and MS supplemented with different combinations of 2，4-D and 6-BA.The results showed that ①callus could be induced from the mature zygotic embryos of Korean pine on all types of media tested，but the earliest generation and highest induction rate was obtained on DCR medium，the callus induction rate on it could reached 93.3%；②relative high callus induction rates were obtained on DCR supplemented with the hormone combinations tested，but the highest rate(96.7%)was obtained from the combinations 2 mg/L 2，4-D plus 0.5 mg/L 6-BA and 6 mg/L 2，4-D plus 1.0 mg/L 6-BA.In conclusion，the proper protocol for callus induction from mature zygotic embryos of Korean pine was DCR supplemented with 2 mg/L 2，4-D plus 0.5 mg/L 6-BA.

Keywords：korean pine；mature zygotic embryo；callus；basic medium；hormone combinations

收稿日期：2014-10-15

基金項目：國家林業局林業公益性行業專項(201204320)；東北林業大學創新訓練項目(201410225149)；齊齊哈爾大學青年科研基金項目(2012k-M22)

作者簡介：第一王祎，本科生。研究方向: 林木種苗培育原理與技術研究。

通訊作者：*沈海龍，博士，教授。研究方向: 林木種苗培育原理與技術研究。E-mail：shenhl-cf@nefu.edu.cn

Proper Condition for Callus Induction from MatureZygotic Embryo Explants ofPinuskoraiensis

Wang Yi1，Zhao Tongtong1，Yang Wei1，Ma Hui1，Ding Lingzhi1，Liang Yan2，Shen Hailong1*

(1.School of Forestry，Northeast Forestry University，Harbin 150040；

2.School of Life Sciences and A & F，Qiqihar University，Qiqihar 161006，Heilongjiang Province)

引文格式：王祎，趙彤彤，楊魏，等.紅松成熟合子胚愈傷組織誘導的適宜培養條件[J].森林工程，2015，31(2)：5-7.

植物愈傷組織培養既是一種植物組織培養微繁的方法，也是植物遺傳改良、種質材料保存和一些有用化合物生產的理想途徑。胚性愈傷組織誘導是目前所有針葉樹種體細胞胚胎發生的必經階段，同時愈傷組織又是優良品種材料保存的主要形式。現代多品種林業(Multi-variety forestry，MVF)的優良品系選育方法中，結合體細胞胚胎發生技術是其中非常重要的一條新途徑[1-3]。其中優良種質材料通過愈傷組織培養形成胚型愈傷組織，一部分直接增殖形成體胚和體胚苗進行鑒定，一部分用液氮保存可達5~10 a，這期間對體胚苗進行生長、形質、材性、抗蟲抗病性等進行鑒定，選出優良種質材料，再利用液氮保存的材料大量增殖[1-3]。因此，愈傷組織特別是胚性愈傷組織的誘導，一直是研究的熱點問題。

紅松(PinuskoraiensisSieb.et Zucc)是溫帶地帶性頂極群落紅松闊葉林的建群種，是我國優質珍貴用材樹種和堅果經濟林樹種，在我國生態環境保護與建設和林區經濟發展及人們生活改善中具有重要意義。但由于長期掠奪性采伐，紅松天然林資源受到極大破壞，急需發展紅松人工林資源，一來可以替代天然林的生產作用，而減少對天然林資源的依賴度；二來可以為林區經濟發展和人們生活水平提高提供更多的資源保證。發展人工林，需要有能夠對優良種質材料進行大量快繁的技術，而體胚發生就是這樣的一項技術[1-5]。基于愈傷組織誘導對體胚發生和MVF中的重要性，本研究選擇紅松的成熟合子胚作為外植體，開展了紅松愈傷組織的誘導關鍵因子和條件的探討分析，旨在為紅松體細胞胚發生技術研究和MVF體系建立奠定基礎。

1材料與方法

1.1　外植體的消毒與接種

先將紅松成熟種子用中性洗滌劑清洗，再用自來水反復沖洗后去種皮，用10%次氯酸鈉浸泡10 min后，用無菌水清洗3～5次，再用0.1%的升汞處理2.5 min，無菌水沖洗3～5次，無菌條件下剝取種胚并將完整合子胚水平接種于培養基上。每個處理接種6皿，每皿5個外植體。培養后30 d觀察統計獲得愈傷組織的外植體數及出愈率。

出愈率(%)=(獲得愈傷組織的外植體數/總的外植體數)×100%

1.2　培養基種類的篩選

將紅松成熟合子胚接種在愈傷組織誘導的不同類型的基本培養基上，添加2，4-D 2 mg/L，6-BA 0.5 mg/L，酸水解酪蛋白500 mg/L，L-谷氨酰胺500 mg/L，蔗糖3%，瓊脂0.6%，pH值5.6～5.8，25℃黑暗條件下培養。其中。誘導20 d后觀察愈傷組織誘導情況，篩選出最佳誘導培養基類型。

1.3　2，4-D和6-BA濃度的篩選

將紅松成熟合子胚接種在分別添加不同濃度2，4-D和6-BA組合的DCR基本培養基上，添加酸水解酪蛋白500 mg/L，L-谷氨酰胺500 mg/L，蔗糖3%，瓊脂0.6%，pH值5.6～5.8，25℃黑暗條件下培養。其中2，4-D濃度分別設置為2、4、6、8 mg/L，6-BA濃度分別設置為0、0.5、1.0 mg/L。誘導30 d后觀察愈傷組織誘導情況，篩選出最佳激素處理組合。

2結果與分析

2.1　基本培養基對愈傷組織誘導的影響

經過滅菌處理的紅松成熟合子胚分別接入GD、DCR、LM和MS 4種不同的誘導培養基上，3～5 d后部分合子胚開始有萌動，表現為子葉微張，胚軸膨大，或在近胚根處先形成接近透明的白色愈傷組織，兩周后胚根處愈傷組織逐漸變為褐色。觀察發現，接種于不同的培養基上的合子胚在培養過程中，在愈傷組織的獲得情況上存在著一定的差異，由表1及觀察可得出，在供試的幾種培養基中，均可誘導紅松成熟合子胚產生愈傷組織，其中DCR培養基中的愈傷組織獲得情況最好，出愈率達到93.3%，與其他各處理的出愈率差異均達到顯著，并且愈傷組織出現最早，約在培養3 d時即出現愈傷組織。綜上結果可見，DCR培養基為誘導紅松合子胚愈傷組織的最佳基本培養基。

表1 基本培養基對紅松成熟合子胚誘導愈傷組織的影響 Tab.1 Effects of media types on callus induction from mature zygotic embryos of Korean pine

注：出愈率后字母表示不同激素組合下的誘導率多重比較結果，標有相同字母表示無顯著差異(α=0.05)。

2.2　2，4-D和6-BA濃度對愈傷組織誘導的影響

在DCR培養基中添加不同濃度組合的2，4-D和6-BA，得到不同的紅松合子胚愈傷組織誘導率，見表2。總體來看，試驗中各個激素組合均可獲得愈傷組織發生，出愈率最高的是在DCR培養基中添加2，4-D 2 mg/L與6-BA 0.5 mg/L的組合及2，4-D 6 mg/L與6-BA 1 mg/L組合，出愈率均達到了96.7%；其次是DCR培養基中添加2，4-D 2 mg/L與6-BA 1.0 mg/L的組合及2，4-D 6 mg/L與6-BA 0.5 mg/L組合，出愈率均達到了93.3%，但與最高出愈率的2個組合差異不顯著。從經濟的角度考慮，最佳的處理組合濃度為向DCR培養基中添加2，4-D 2 mg/L與6-BA 0.5 mg/L。實際觀測結果也表明，高濃度的2，4-D與低濃度的6-BA組合更有利于紅松成熟合子胚的愈傷組織的誘導。圖1是在DCR + 2，4-D 2 mg/L + 6-BA 0.5 mg/L方案下誘導產生的愈傷組織。

表2　2，4-D和6-BA濃度對紅松成熟合子胚誘導愈傷組織的影響 Tab.2 Effect of 2，4-D and 6-BA concentrations on callus induction from mature zygotic embryos of Korean pine

注：出愈率后字母表示不同激素組合下的誘導率多重比較結果，標有相同字母表示無顯著差異(α=0.05)。

圖1　DCR培養基添加2 mg o L -1 2，4-D+ 0.5 mg o L -1 6-BA誘導15 d形成的紅松愈傷組織 Fig.1 Korean pine callus formed on DCR medium supplemented with 2 mg/L 2，4-D plus 0.5 mg/L 6-BA at 15 days culture

3結論與討論

研究結果表明，供試的GD、DCR、LM、MS等4種培養基均可以從紅松成熟合子胚外植體上誘導產生愈傷組織，但在DCR培養基上誘導的愈傷組織出現最早，出愈率顯著高于其他培養基；在篩選出的DCR培養基中添加2 mg/L的2，4-D與0.5 mg/L的6-BA或添加6 mg/L的2，4-D與1.0 mg/L的6-BA，可獲得96.7%的最高愈傷組織誘導率。因此，可以確定，DCR + 2，4-D 2 mg/L+6-BA 0.5 mg/L為從紅松成熟合子胚外植體誘導產生愈傷組織的最佳方案。

成熟胚由于取材、處理、保存方便，同時又具備胚性較強、便于生產應用的特點，常常是進行愈傷組織誘導和體胚發生首選的外植體類型[3，5-12]，喜瑪拉雅白皮松(P.geradiana)[5]、糖松(P.lambertiana)[5]、喬松(P.wallichiana)[5]、華北落葉松(Larixprincipis-rupprechtii)[6]、華山松(P.armandii)[7]、濕地松(P.elliottii)[8]、杉木(Cunninghamialanceolata)[9]、思茅松(P.kesiyavar.langbianensis)[10]、興安落葉松((Larixgmelini)[11]和云南松(P.yunnanensis)[12]等均用成熟胚誘導獲得了愈傷組織。本項研究也表明，紅松成熟胚作為外植體誘導愈傷組織是可行的。

通過選擇適宜培養基或改良培養基配方是建立一個樹種組織培養方案的第一步，針葉樹愈傷組織誘導常用培養基主要有BLG、DCR、EDM、EM、GD、Glitz、LM、LPG、MS、MSG、SH、WPMG等[2，5-12]，其中，無機鹽含量較低、特別是NO-3和NH+4總量較低的DCR是松屬樹種應用成功最多的一種基本培養基[5，10，12]。本試驗結果證明，DCR培養基的誘導紅松成熟胚產生愈傷組織的效果明顯好于其它培養基，這說明紅松成熟合子胚的愈傷組織誘導符合多數松屬樹種對培養基組成成分的要求特點。

激素的種類及配比對植物愈傷組織的誘導會產生重要的影響。眾多試驗研究表明針葉樹植物愈傷組織的誘導一般在含有較高濃度的生長素和較低濃度的細胞分裂素的培養基上進行，其中以2，4-D和6-BA組合最為常見和有效[2，5-12]。本項研究結果表明，2，4-D和6-BA的適宜組合也是紅松成熟胚愈傷組織誘導的條件，與大多數松屬樹種的要求一致。

探索一個樹種的組織培養方案時，篩選適宜的基本培養基類型和合適的細胞分裂素與生長素濃度組合都是基本步驟。本研究篩選確定了紅松成熟合子胚愈傷組織的適宜基本培養基和合適的激素濃度組合，為下一步的愈傷組織的保持與增殖、體胚的誘導、體細胞胚的萌發、轉化等其他環節的實驗研究奠定了基礎。

【參考文獻】

[1]Park Y S.Conifer somatic embryogenesis and multi-varietal forestry [A].In：Trevor F(Ed.).Challenges and Opportunities for the World’s Forests in the 21st Century[M].Netherlands：Springer，2014：425-439.

[2]Find J I，Hargreaves C L，Reeves C B.Progress towards initiation of somatic embryogenesis from differentiated tissues of radiata pine(Pinus radiata D.Don)using cotyledonary embryos [J].In Vitro Cell.Dev.Biol.Plant，2014，50：190-198.

[3]Lelu-Walter M A，Thompson D，Harvengt L，et al.Somatic embryogenesis in forestry with a focus on Europe state-of-the-art，benefits，challenges and future direction [J].Tree Genetics & Genomes，2013，9：883-899.

[4]Pullman G S，Bucalo K.Pine somatic embryogenesis：analyses of seed tissue and medium to improve protocol development [J].New Forests，2014，45(3)：353-377.

[5]Pullman G S，Bucalo K.Pine somatic embryogenesis using zygotic embryos as explants [A].In：Trevor A.Thorpe and Edward C.Yeung(eds.)，Plant Embryo Culture：Methods and Protocols[M].Humana Press，2011：267-291.

[6]韓登媛，李旦，趙健，等.華北落葉松胚性愈傷組織誘導影響因子的研究[J].林業科學研究，2013，26(4)：454-458.

[7]逯昀，孫景梅，侯佳.華山松胚性愈傷組織的誘導研究[J].北方園藝，2010(11)：155-157.

[8]何月秋，池樹友.激素對誘導濕地松成熟胚胚性愈傷組織影響的初步研究[J].四川林業科技，2007，28(1)：74-76，80.

[9]席夢利，施季森.杉木合子胚愈傷組織的誘導及植株再生[J].南京林業大學學報(自然科學版)，2006，30(2)：6-10.

[10]吳濤，陳少瑜，陳芳，等.思茅松胚性愈傷組織的誘導[J].中南林業科技大學學報，2007，27(5)：74-78.

[11]趙曉敏，沈海龍，楊玲，等.興安落葉松胚性愈傷組織誘導影響因子的研究[J].植物研究，2007，27(5)：538-543.

[12]于大德，肖寧，王企珂，等.云南松胚性愈傷組織誘導及增殖[J].西北植物學報，2011，31(10)：2119-2123.

[責任編輯：劉美爽]