新疆維、漢族鼻咽癌患者LMP2A特異性T細胞免疫反應差異性研究

新疆維、漢族鼻咽癌患者LMP2A特異性T細胞免疫反應差異性研究

譚遙1， 陳婷1， 李亞偉1， 王若崢1,2

(新疆醫科大學1附屬腫瘤醫院放療中心,2新疆腫瘤學重點實驗室， 烏魯木齊830011)

摘要：目的探討新疆維吾爾族、漢族鼻咽癌患者外周血潛伏膜蛋白2A(LMP2A)特異性T細胞免疫反應的差異性。方法選擇114例鼻咽癌初治患者(維吾爾族48例,漢族66例)及120例健康志愿者(維吾爾族50例,漢族70例)，治療前抽取肘靜脈血，分離外周血單個核細胞，采用酶聯免疫斑點法(ELISPOT)檢測外周血中LMP2A特異性T細胞(CTL)水平。比較鼻咽癌患者與健康志愿者、維吾爾族患者與維吾爾族健康志愿者、漢族患者與漢族健康志愿者、維吾爾族患者與漢族患者外周血LMP2A特異性CTL頻數的差異。結果鼻咽癌患者的外周血LMP2A特異性CTL水平明顯低于健康志愿者(P=0.031 6)；維吾爾族鼻咽癌患者和漢族鼻咽癌患者分別與同民族健康志愿者比較，外周血LMP2A特異性CTL頻數均低于同民族健康志愿者(P=0.032 9，P=0.047 9)，差異有統計學意義；漢族鼻咽癌的外周血中LMP2A特異性CTL水平亦高于維吾爾族鼻咽癌患者，差異有統計學意義(P=0.022 7)。結論鼻咽癌患者對于LMP2A特異性的T細胞免疫反應明顯低于健康人群，這可能是EBV潛伏感染，最終導致鼻咽癌發生的重要原因之一。

關鍵詞：鼻咽癌； 潛伏膜蛋白2A； 酶聯免疫斑點法； 特異性T細胞

中圖分類號：R739.63文獻標識碼：A

doi:10.3969/j.issn.1009-5551.2015.01.001

[收稿日期：2014-10-21]

基金項目：國家自然科學基金(81160327)，新疆維吾爾自治區國際合作項目(201141138，20126024)，科技部國際合作項目(2012DFA31560)

作者簡介：劉凱(1989-)，男，在讀碩士，研究方向：頭頸部腫瘤放射治療基礎與臨床。

On the differential immune reaction of the LMP2A spicific T cell in Han and Uyghur

nasopharyngeal carcinoma patients in the Xinjiang Autonomous Region of China

TAN Yao1， CHEN Ting1， LI Yawei1, WANG Ruozheng1,2

(1DepartmentofRadiationOncology,AffiliatedTumorHospital,2KeyLaboratoryofOncology,

XinjiangMedicalUniversity,Urumqi830011，China)

Abstract：ObjectiveTo study the differential immune reaction of the LMP2A spicific T cell in Han and Uyghur nasopharyngeal carcinoma patients in Xinjiang. Methods114 Nasopharyngeal Carcinoma patients (Uyghur 48, Han 66) and 120 healthy donors (Uyghur 50, Han 70) were included in the study. 10 ml blood were taken before any treatment, PBMCs were separated and LMP2A specific T cell responses were measured by using ELISPOT assay. Compare the differences between nasopharyngeal carcinoma patients and healthy donors, Uyghur nasopharyngeal carcinoma patients and Uyghur healthy donors, Han nasopharyngeal carcinoma patients and Han healthy donors, Uyghur nasopharyngeal carcinoma patients and Han nasopharyngeal carcinoma patients. ResultsWe found significant difference of LMP2A specific T cell responses between NPC patients and healthy donors (P=0.031 6). We also found the significant difference of LMP2A specific T cell responses in another 3 groups：Uyghur NPC patients and Uyghur healthy donors (P=0.032 9)， Han NPC patients and Han healthy donors (P=0.047 9)， Uyghur and Han NPC patients (P=0.022 7). ConclusionThe lower immune reaction of the LMP2A spicific T cell in nasopharyngeal carcinoma patients may be one of the most important reasons about latent EBV infection, and eventually lead to the occurrence of nasopharyngeal carcinoma.

Key words: nasopharyngeal carcinoma; latent membrane protein 2; enzyme link immunal spot; specific T cells

鼻咽癌是來源于鼻咽部上皮的一種惡性腫瘤，其在我國東南沿海地區高發，在眾多的發病因素中，EB病毒(Epstein-Barr viru,EBV)的感染仍然是鼻咽癌發病的主要因素之一[1-4]。研究表明EBV主要表達潛伏膜蛋白1、2(LMP1、2)、EBV病毒核抗原1(EBNA1)等抗原[5]。其中LMP2又可以分為LMP2A、LMP2B，LMP2A被認為可以提高上皮細胞生長和分化能力，并且與鼻咽癌的侵襲和轉移有一定的相關性,屬于功能結構；LMP2B則通過調節LMP2A、LMP1的功能發揮作用。在人體內針對病毒的免疫反應中，細胞免疫起主要作用，而T細胞是細胞免疫中能夠直接殺傷外來入侵抗原的主要細胞之一。EBV作為一種外來病毒可以在鼻咽癌患者體內長期潛伏并最終在局部產生腫瘤組織，是否可以推測鼻咽癌患者對EBV的特異性T細胞反應減弱，最終導致EBV逃脫了機體的免疫監視[6]?；谶@一假設，本研究采用酶聯免疫斑點法(ELISPOT)對初治114例維吾爾族(維族)、漢族鼻咽癌患者LMP2A特異性多肽介導的T細胞免疫反應進行檢測，并與健康人群進行比較，現報道如下。

1資料與方法

1.1研究對象選擇新疆醫科大學附屬腫瘤醫院頭頸放療科2008年1月-2013年12月收治的114例鼻咽癌初治患者，其中漢族66例，維吾爾族患者48例，所有患者均經過病理確診，簽署知情同意書。選擇新疆醫科大學及新疆醫科大學附屬腫瘤醫院的健康志愿者為健康組，其中漢族70例，維吾爾族50例，所有健康志愿者與患者均無親緣關系，維、漢族鼻咽癌患者一般情況見表1。

表1　維、漢族鼻咽癌患者一般情況

1.2外周血單個核細胞采集患者入院在未行任何治療前抽取肘靜脈血10 mL(EDTA抗凝)，采用密度梯度離心法分離外周血單個核細胞(PBMC)，胎酚蘭染色計數，將細胞重懸，終濃度為4×106個/mL備用進行檢測。健康志愿者抽取肘靜脈血10 mL(EDTA抗凝)，采用同樣的方法制備細胞懸液，用于ELISPOT檢測。

1.3LMP2A特異性T細胞免疫反應檢測用ELISPOT試劑盒(MABTECH Australia)的一抗包被帶硝酸纖維素膜的96孔板，2 h后用含10%胎牛血清(Sigma American)的細胞培養液(1640 Sigma American)阻斷反應，向96孔板中加入制備好的細胞懸液50 μL，同時加入LMP2A全基因組特異性多肽(參考EBV-LMP2A多肽庫的序列圖，由牛津大學MRC人類免疫學實驗室合成)，設立陰性對照孔(加入50 μL 細胞培養液)，陽性對照孔加入2 μL植物血凝素(PHA)，將反應體系放入5% CO2、37℃孵育箱中過夜培養。第2天采用無菌PBS洗板6次，加入稀釋好的二抗50 μL，加蓋后室溫放置2 h；再次用無菌PBS洗板6次，每孔中加入稀釋好的三抗，加蓋后室溫下放置45 min；按說明書配制ALP顯色液，每孔加入50 μL，加蓋后室溫下放置15～20 min，去離子水沖洗96孔板。

1.4ELISPOT實驗結果的判定標準及質控根據2006年美國病毒學雜志的報道和國內應用相同技術的研究資料提出的標準[7]，參考文獻[8]的判定標準陽性對照為每孔斑點數≥50個/106個細胞，陰性對照為斑點數≤5個/106個細胞。采用AID讀板機讀取反應斑點數，并記錄備統計學分析。為保證實驗結果的真實準確，實驗試劑采用同一廠家、同一批次；實驗設立質控標本，每周進行1次質控檢測。

1.5統計學處理應用SAS9.2統計軟件對實驗數據進行統計學分析，對鼻咽癌患者與健康志愿者的LMP2A特異性T細胞(CTL)免疫反應產生細胞數目進行t檢驗，分別對維吾爾族患者和漢族患者之間、維吾爾族患者和維吾爾族健康志愿者、漢族患者和漢族健康志愿者之間LMP2A特異性CTL數進行t檢驗，檢驗水準P=0.05。

2結果

2.1鼻咽癌患者與健康志愿者LMP2A特異性T細胞免疫反應比較鼻咽癌患者LMP2A特異性CTL水平明顯低于健康志愿者，差異有統計學意義(P=0.031 6)，見表2。

表2鼻咽癌患者與健康志愿者LMP2A特異性CTL數比較/(個/106,±s)

LMP2A特異性CTL數-x±s標準誤t值P值鼻咽癌患者169.85±188.3022.832.1740.0316健康志愿者295.59±432.1756.26

2.2維吾爾族、漢族鼻咽癌患者與維吾爾族、漢族健康志愿者LMP2A特異性T細胞免疫反應比較維吾爾族和漢族鼻咽癌患者外周血LMP2A特異性CTL水平均低于健康志愿者，差異有統計學意義(P=0.032 9，P=0.047 9)，見表3。

2.3維吾爾族、漢族鼻咽癌患者LMP2A特異性T細胞免疫反應比較維吾爾族鼻咽癌患者LMP2A特異性CTL水平明顯低于漢族患者，差異有統計學意義(P=0.022 7)，見表4。

表3維、漢族鼻咽癌患者與維吾爾族、漢族健康志愿者

LMP2A特異性CTL數比較/(個/106,±s)

LMP2A特異性CTL數-x±s標準誤t值P值維吾爾族鼻咽癌患者100.00±88.1517.992.1870.0329維吾爾族健康所愿者337.79±526.0490.22漢族鼻咽癌患者207.95±216.5232.640.7110.0479漢族健康志愿者241.25±244.3832.65

表4維族、漢族鼻咽癌患者LMP2A特異性CTL數

比較/(個/106,±s)

LMP2A特異性CTL數-x±s標準誤t值P值維吾爾族鼻咽癌患者100.00±88.1517.992.3330.0227漢族鼻咽癌患者207.95±216.5232.64

3討論

多年來，EBV和鼻咽癌的關系一直是研究的重點，眾多的研究也表明EBV是鼻咽癌的主要致病原因之一，LMP是EBV表達的抗原蛋白，其表型包括LMP1、LMP2A和 LMP2B，其中主要具有免疫原性的單元為LMP2A[5-6,9]。在EBV 陽性表達的部分惡性腫瘤，如鼻咽癌、霍奇金淋巴瘤、外周T細胞淋巴瘤中也可檢測到LMP2A表達，提示LMP2A可能參與EBV的長期潛伏，幫助其逃過免疫系統的監視，并且可能在惡性腫瘤的發生、發展中起一定作用[10-12]。Li等[13]用LMP2A轉染人類角質化細胞株HaCaT，使細胞的增殖和分化能力明顯增強，并成功地在裸鼠體內增殖形成移植瘤。在EBV潛伏感染的B細胞中，幾乎都可以檢測出LMP2A的基因產物，提示其具有潛在的T細胞激活表位，能介導殺傷性T細胞發揮作用。CTL細胞能否識別并殺傷LMP2A感染的靶細胞是能否清除EBV感染并抑制其進一步發展的關鍵,近期已經開始有研究將LMP2作為疫苗免疫EBV陽性的鼻咽癌患者，Ⅰ期臨床試驗結果提示安全且能有效提高特異性免疫反應[14]。

細胞免疫是機體應對病毒感染的主要免疫方式。被病毒感染的細胞或者腫瘤細胞表面可以表達特異性的抗原決定簇(由8～10個氨基酸的序列構成)，抗原決定簇與主要組織相容性復合體Ⅰ類分子(major histocompatibility complex,MHCⅠ)形成的復合物，從而被CTL細胞識別，并誘導其產生特異性殺傷功能，T細胞同時可以分泌腫瘤壞死因子(TNF)、白介素(IL)、干擾素(IFN)等細胞因子而發揮效應。CTL可以直接殺傷靶細胞。ELISPOT技術是目前國際上先進的檢測特異性CTL功能和數量的方法，通過檢測分離出的外周血中CTL細胞對于特異性抗原刺激后分泌IFN-γ的淋巴細胞的水平,判斷CTL細胞的功能，是目前最為靈敏的免疫功能檢測方法，普遍用于各種免疫研究中[15-18]。

本研究顯示，鼻咽癌患者外周血LMP2A特異性的CTL細胞數目明顯少于健康志愿者，差異有統計學意義。維吾爾族患者與維吾爾族健康志愿者、漢族患者與漢族健康志愿者的比較均得到了相似的結果，提示鼻咽癌患者對LMP2A抗原刺激的免疫反應能力明顯低于健康人群。本課題組前期的研究結果也提示鼻咽癌患者外周血中LMP特異性CTL水平在治療前后存在差異，治療后6個月明顯高于治療前水平[8]，與本次實驗結果相似。由于LMP2對EBV的潛伏感染起到重要的作用，可能是EBV相關的惡性腫瘤發生、發展的重要環節之一[19]。鼻咽癌患者對LMP2A的免疫識別和清除能力下降，可能最終導致EBV在局部長期潛伏感染，并刺激上皮增生，導致腫瘤的最終發生。

本研究發現維吾爾族和漢族鼻咽癌患者外周血中的LMP2A特異性CTL數目存在差異。由于LMP2A已經被發現是通過HLA-A2限制性CTL來被免疫系統識別、產生免疫反應的，Chen等[20]對HLA的研究結果也提示，維吾爾族和漢族人群在HLA-A2的表型上存在明顯的差異，維吾爾族人群更接近于高加索人種。維吾爾族和漢族患者LMP2A特異性CTL數目的差異主要可能還是由于2個民族在HLA-A2的分布差異導致的，通過對HLA-A2和外周血LMP2A特異性CTL水平進行聯合研究可能可以得到較為明確的答案。

綜上所述，鼻咽癌患者對于LMP2A特異性的T細胞免疫反應明顯低于健康人群，這可能是EBV潛伏感染、最終導致鼻咽癌發生的重要原因之一，通過提高機體對LMP2A的識別及免疫反應，可能是對鼻咽癌患者進行免疫治療的途徑之一。

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(本文編輯周芳)

通信作者：王若崢，女，博士，教授，主任醫師，博士生導師，研究方向：腫瘤放射治療應用基礎和臨床應用，E-mail：wrz8526@163.com。