冷熱護理刺激對人宮頸癌HeLa細胞克隆形成能力的影響及機制的初步研究

·科研論著·

冷熱護理刺激對人宮頸癌HeLa細胞克隆形成能力的影響及機制的初步研究

羅羽，王仙園

摘要：[目的]研究冷熱護理刺激對人宮頸癌HeLa細胞克隆形成能力的影響及機制，以期探索冷熱護理的新作用機制，促進臨床護理水平的提高。[方法] HeLa細胞按常規用DMEM 高糖培養基培養；按6孔板每孔100個～300個細胞的濃度接種并在不同培養溫度情況下進行細胞克隆試驗；提取在不同溫度環境下生長的同批次HeLa細胞的總RNA，在逆轉錄反應后獲得cDNA，以此為模板，實施熒光定量分析不同溫度環境下pan-QKI mRNA的表達水平。[結果]較高的環境溫度能增強HeLa細胞的克隆形成能力，抑制pan-QKI mRNA表達；但較低的環境溫度則抑制了該細胞的克隆形成，同時，pan-QKI mRNA表達水平顯著增高。[結論]溫度干預能對人宮頸癌HeLa細胞的克隆能力產生影響， pan-QKI 在不同溫度環境中的表達變化可能是導致HeLa細胞克隆形成能力差別的重要原因，溫度干預的護理效用和機制值得深入探究。

關鍵詞：冷熱護理；宮頸癌；HeLa細胞；細胞克隆；護理干預

中圖分類號：R471

基金項目：國家自然科學基金資助項目，編號：31271239；國家重點基礎研究發展“973”計劃資助項目，編號：2009CB941601。

作者簡介：羅羽，教授，博士，單位：400038，中國人民解放軍第三軍醫大學護理學院；王仙園(

收稿日期：(2014-05-15；修回日期：2014-12-13)

Preliminary study on influence of hot and cold care stimulus on forming ability of human cervical cancer HeLa cells clone and its mechanism

Luo Yu，Wang Xianyuan(Nursing College of Third Military Medical University of PLA，Chongqing 400038 China)

AbstractObjective：To probe into the influence of hot and cold care stimulus on forming ability of human cervical cancer HeLa cells clone and its mechanism，so as to explore the new action mechanism of hot and cold care promote the improvement of clinical nursing level.Methods：HeLa cells were cultured by routine use of DMEM high glucose medium.According the concentration of 100~300 cells per hole，they were inoculated in 6 hole plate，cell cloning experiments were carried out in different culture temperature circumstances；the total RNA of the same batch of HeLa cells was extracted which grew in different temperatures，the cDNA obtained in the reverse transcription reaction was taken as a template，the fluorescent quantitative analysis was implemented for expression level of pan-QKI mRNA under different temperature environment.Results：The high ambient temperature can enhance the colony formation ability of HeLa cells and inhibit the pan-QKI mRNA expression；but the lower ambient temperature inhibited the cell clone formation，at the same time，the expression level of mRNA was significantly increased in pan-QKI.Conclusion：Temperature intervention can affect cloning ability of human cervical cancer HeLa cells.The changes of pan-QKI expression in different temperature environments may be an important reason of differences of HeLa cell clone forming ability.The efficacy and mechanism of temperature intervention are worth for in-depth inquiry.

Key wordshot and cold care；cervical cancer；HeLa cell；cell clone；nursing intervention

現代分子醫學證實，宮頸癌是女性在其個人獨特基因型基礎上、在不同社會文化環境等內外因素的共同作用下發生的子宮頸管或陰道部位細胞的惡性增生，每位宮頸癌病人具有的基因表達失控狀態可能不盡相同，因而其發病具有一定的基因獨特性。隨著對宮頸癌發生、發展、轉移的分子醫學機制研究的不斷深入，以及人類實施基因改造和基因干預手段的日漸成熟，依據最新的基因學發現和新技術為宮頸癌病人及其高危人群量身設計出特異性基因治療方案和策略應該在不久的未來實現，基因治療和基于基因治療理論的護理干預即將成為防治宮頸癌的最有效手段。許多傳統的護理干預手段在腫瘤護理中的作用也有必要利用新技術和新手段進行探索，以利于發現其可能在基因調控中的獨特作用，利于基因護理學的發展。冷熱護理是目前臨床護理的常見手段，在臨床上的運用和研究出發點大多局限在對冷和熱產生的生理效用方面[1]。護理領域缺乏對冷熱護理干預或刺激的分子層面的深層次研究。2013年10月，美國科學院院刊發表一篇關于飼養環境影響小鼠癌細胞生長和轉移的文章，提出溫度刺激可能是影響腫瘤細胞增殖的主要因素[2]。本課題組據此設計和開展了冷熱護理刺激對人宮頸癌細胞生長和轉移的系列研究，期望為傳統護理干預的護理效用和機制研究增加新的證據，也期望挖掘出古老的冷熱護理干預的新功效，為臨床腫瘤護理新干預措施的制定和開發提供依據。

1材料與方法

1.1細胞株實驗用人宮頸癌HeLa細胞株和經miR-574-5p抑制的慢病毒感染后篩選出的miR-574-5p穩定低表達HeLa株均為細胞應激國家重點實驗室(廈門大學)保存。

1.2主要材料與設備HeLa細胞培養采用添加了10%胎牛血清和1%青鏈霉素雙抗的GIBCO生產的DMEM完全培養基；胎牛血清由北京全式金生物技術有限公司生產；青霉素、鏈霉素以及消化細胞使用的胰酶均購自生工生物工程(上海)股份有限公司；PBS 磷酸鹽緩沖液購自北京市中杉金橋生物技術有限公司，按說明制備后高壓蒸汽滅菌后使用；細胞培養所用的二氧化碳培養箱為Thermo ElectronForma的Series Ⅱ型產品；拍攝細胞所用相機為日本尼康株式會社產品；超凈工作臺由蘇州凈化設備公司生產，型號為SterilGARD?Advance；RT-PCR試劑盒購自TAKARA公司，PrimescriptTMRT reagent kit with gDNA Eraser(Perfect Real Time)；實時熒光定量PCR試劑盒為廣東東盛生物科技有限公司的SYBR?Green qPCR Mix(High Rox+)；微量移液器為德國 Eppendorf 產品；電動移液管助吸器由德國Brand公司生產，型號為ACCU-jet?Pro。

1.3細胞克隆形成能力檢測取生長狀態良好、處對數生長期的HeLa細胞，常規胰酶消化后，用標準血細胞計數板計數細胞，確保6孔板中每個孔內接種細胞數量100個～300個。分別置于含5%二氧化碳的不同孵育溫度的培養箱中。每天觀察細胞生長情況，2d～3 d為細胞更換DMEM完全培養基1次，克隆培養時間6 d。到達預期孵育時相點終止培養，用微量負壓泵吸去培養基，PBS清洗細胞1次或2次后，用100%甲醇在4 ℃固定細胞20 min；PBS清洗1次或2次后，以0.2%結晶紫染液室溫染色30 min。染色結束后，PBS清洗3次～5次，室溫晾干、拍照。

1.4細胞總RNA提取胰酶消化細胞后，按試劑盒指示用Trizol進行HeLa細胞總RNA提取并測定濃度，-80 ℃保存備用。

1.5cDNA制備按照TAKARA PrimescriptTMRT reagent kit with gDNA Eraser(Perfect Real Time)說明書在Bio-RAD PCR擴增儀內對已經抽提出的總RNA實施逆轉錄反應，反應體系為10 μL。

1.6實時熒光定量PCR測定按廣東東盛科技SYBR?Green qPCR Mix(High Rox+)說明書構建總體積為10 μL的反應體系，以95 ℃預熱1 min后，95 ℃ 10 s、58 ℃ 15 s、72 ℃ 20 s(收集熒光)，重復40個循環反應條件進行real-time qPCR反應。樣品以18S rRNA為內參，細胞設置3個獨立平行樣，每個獨立平行樣進行4次重復測定。檢測樣本的CT值在測定結束后讀取，具體數據采用2 - △△ CT法進行分析處理。人pan-QKI real-time qPCR引物序列，Forward：CACTGTGGAAGATGCTCAGAA；Reverse：CATCAGCTGCATCTTCTTCAG。

1.7統計學處理數據分析使用GraphPad Prism5.00軟件，采用t檢驗或單因素方差分析(ANOVA)進行統計學分析并制圖。P<0.05為差異具有統計學意義。

2結果

2.138 ℃溫度環境顯著增強了HeLa細胞的克隆形成能力本研究發現，38 ℃的孵育溫度環境能較常規37 ℃孵育顯著增強HeLa細胞的克隆形成能力，在miR-574-5p正常表達組和抑制組的變化趨勢一致。見圖1。圖中第1行、第3行為不同溫度下miR-574-5P正常表達的Hela細胞，第2行、第4行為不同溫度下miR-574-5P表達抑制的Hela細胞。

圖1　38 ℃與37 ℃溫度環境下HeLa細胞的克隆形成能力比較

2.235 ℃溫度環境輕度降低HeLa細胞的克隆形成能力比較35 ℃和37 ℃孵育時HeLa細胞克隆形成情況，發現在這兩個溫度環境下細胞克隆形成相差不大，35 ℃孵育似能輕微降低miR-574-5p抑制組細胞克隆形成。見圖2。圖中第1行、第3行為不同溫度下miR-574-5P正常表達的Hela細胞，第2行、第4行為不同溫度下miR-574-5P表達抑制的Hela細胞。

圖2　35 ℃與37 ℃溫度環境下HeLa細胞的克隆形成能力比較

2.333 ℃溫度環境顯著降低HeLa細胞的克隆形成能力進一步觀察該細胞在更低的33 ℃與常規37 ℃孵育克隆形成情況，結果顯示，33 ℃孵育能明顯降低HeLa細胞的克隆形成能力，且miR-574-5p正常表達組和抑制組克隆能力下降趨勢一致。見圖3。圖中第1行、第3行為不同溫度下miR-574-5P正常表達的Hela細胞，第2行、第4行為不同溫度下miR-574-5P表達抑制的Hela細胞。

圖3　33 ℃與37 ℃溫度環境下HeLa細胞的克隆形成能力比較

2.4溫度干預能影響HeLa細胞pan-QKI的mRNA表達為探究溫度干預和刺激引起HeLa細胞克隆形成能力的機制，分別提取了在上述不同溫度環境生長的HeLa細胞總RNA，在逆轉錄獲得cDNA后，進行了pan-QKI mRNA表達的實時熒光定量PCR檢測。研究顯示，不同溫度孵育組HeLa細胞pan-QKI mRNA的表達出現明顯變化。與常溫37 ℃孵育組相比，38 ℃孵育組細胞pan-QKI mRNA表達出現無統計學意義的輕度下降，降幅約10%，而35 ℃、33 ℃孵育組細胞pan-QKI mRNA的表達與37 ℃組相比均呈現有統計學意義的上升，且隨著溫度降低，其細胞pan-QKI mRNA表達增高程度更大。見圖4。

圖4　不同環境溫度下HeLa細胞pan-QKI mRNA表達

3討論

冷熱療法(cold and heat therapy)是指利用冷、熱刺激引起的神經傳導，導致皮膚和內臟器官血管收縮和舒張，改變人體循環和新陳代謝水平，最終達到治療、護理目的的一種常見方法[1]。目前臨床護理中除了常將其運用于病人的降溫、保溫，有目的地使外周血管收縮或擴張以達到預期目的外，也有不少關于將冷熱護理運用在預防乳腺癌術后化療引起的化學性靜脈炎[3]、會陰部側切的護理中[4]，甚至在外科膝關節置換術后的康復中冷熱療法能起到明顯作用[5]的報道。這些冷熱護理的臨床應用雖然使用部位不一，但多是基于冷熱護理改變局部血液循環和新陳代謝的生理機制而開展的臨床應用。冷和熱作為一種特殊刺激，是否能如同滲透壓改變、缺氧刺激、輻射暴露等一樣[6-10]，刺激機體產生其他更細微的分子和基因層面的應急反應，進而對機體的代謝和細胞生長產生影響？若能獲得明確證據，則冷熱護理的臨床作用可以據此得到更好的認識，冷熱護理的臨床應用空間也將得到擴增，而護理界對常規護理干預的認識將會得以豐富。

眾所周知，開展臨床護理干預研究的前提是獲得準確的實驗室研究實證，結合溫度刺激的相關文獻，本研究設計了3種不同的環境溫度刺激與最接近人體的常規培養溫度37 ℃，分別進行了不同的環境溫度刺激對人宮頸癌HeLa細胞克隆形成能力的對比研究，發現略高于人體正常體溫的38 ℃孵育溫度刺激明顯增強了HeLa細胞的克隆形成能力，而明顯低于體溫的溫度刺激，包括在35 ℃和33 ℃的溫度刺激下細胞的克隆形成能力均明顯變弱，這種形態學上的證據顯示，對于HeLa細胞而言，較正常人體更低的溫度環境不利于腫瘤的生長。近期，美國科學院院刊(Proc Natl Acad Sci USA)在2013年10月也報道，小鼠的飼養環境溫度能改變小鼠癌細胞的生長和擴散，進而對其腫瘤的發生和發展產生影響，在比常溫更高的飼養環境下，如30 ℃～31 ℃的生長環境溫度下活體小鼠的癌癥更容易得到控制，學者們還發現小鼠癌細胞在偏冷的環境更容易生長[2]。該研究也從一個側面證明了改變腫瘤生長的環境溫度可能是抑制腫瘤生長的一種有效干預策略，可供臨床參考。當然，從體外實驗細胞層面的研究到體內試驗驗證，再到臨床病人的實際應用，需要進行的研究還很多，需要更系統和更深入的研究。

關于溫度刺激為何能引起人宮頸癌HeLa細胞的克隆能力變化，本研究也進行了初步探究。Quaking信號蛋白(QKI)屬信號轉導與RNA活化(signal transduction and activation of RNA，STAR)家族成員，是一類特殊的、集合了信號轉導和RNA激活功能為一體的蛋白質[11]。最新生物信息學分析顯示，QKI可通過與多種mRNA上的Quaking 反應原件(quaking response elements，QRE)的相互作用，調控包括多種原癌基因、細胞周期蛋白在內的超過1 400種mRNAs[12]，QKI蛋白借助這些機制調控腫瘤的發生、發展和轉歸已經獲得證實，如QKI就已被發現是結直腸癌細胞的重要抑癌蛋白[13]。本研究也顯示，在38 ℃高于體溫的溫度環境下，HeLa細胞中pan-QKI mRNA的表達水平出現降低，而在35 ℃和33 ℃的較低溫度環境刺激下，該細胞的pan-QKI mRNA表達水平卻出現明顯變化，顯著高于接近人體溫度的37 ℃時的表達。這一結果在證明了QKI在人宮頸癌中也同樣具有抑癌作用的同時，還證實了溫度刺激能通過影響一些RNA結合蛋白的表達，影響宮頸癌腫瘤細胞的克隆形成和生長。這一研究結果對開發抑制腫瘤形成和抑制的策略具有積極作用。本研究還提示，溫度護理干預可能通過復雜的機制起到超出護理界既往確定的更多重要作用，值得護理同行們深究。

4小結

冷熱護理是護理專業基礎課程《基礎護理學》教材中的重要內容，臨床護理中也常常使用冷熱療法對病人進行癥狀控制，但冷和熱在臨床護理中運用時導致的影響既往多局限于對人體生理學影響層面，護理領域缺乏分子層面的深層次研究。本研究利用分子生物學和分子醫學的一些研究手段，進行了溫度對腫瘤細胞克隆形成能力和機制方面的初步探索，獲得了系列明證。這充分證明對于一些傳統護理干預的作用機制和作用有必要對其進行新的探索；另一方面，在護理臨床研究中也需要護理研究者充分利用先進的研究方法開展研究，不斷借鑒其他相關學科的研究手段和研究思路，更好地促進護理研究工作的開展，促進護理學科的進步。

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(本文編輯李亞琴)