高效液相色譜測(cè)定木薯塊根β—胡蘿卜素的方法優(yōu)化

楊龍+周鍇+安飛飛+李開綿+陳松筆

摘 要 為確定高效液相色譜法測(cè)定木薯β-胡蘿卜素的最佳方法，以丙酮/石油醚（2/5，V/V）為提取液，甲醇/叔丁基甲醚（70/30，V/V）為流動(dòng)相，對(duì)白心木薯SC101和蛋黃木薯SC9塊根β-胡蘿卜素保留時(shí)間及其分離情況進(jìn)行研究。檢測(cè)條件為：色譜柱YCM C30，柱溫30℃，流速為1 mL/min等度洗脫。結(jié)果顯示：該方法精確度和重復(fù)性的變異系數(shù)均小于5%，保留時(shí)間為12.65 min，在2～30 μg/mL濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好（y= 209.11x-14.114，R2=0.9993）；平均回收率為81%～92 %。采用改進(jìn)的HPLC法對(duì)木薯塊根β-胡蘿卜素進(jìn)行測(cè)定，數(shù)據(jù)穩(wěn)定性好，分析時(shí)間比已報(bào)道的方法縮短30 min以上，適用于快速定量分析木薯塊根的微量β-胡蘿卜素含量。

關(guān)鍵詞 木薯 ；β-胡蘿卜素；HPLC；定量分析

分類號(hào) S482.4

Optimization of HPLC Determination Method for β-carotene

in Cassava Tuberous Roots

YANG Long ZHOU Kai AN Feifei LI Kaimian CHEN Songbi

（1 Tropical Crops Genetic Resources Institute / Key Laboratory of Ministry of Agriculture for Germplasm Resources Conservation and Utilization of Cassava， CATAS，Danzhou 571737；

2 Subtropical Crops Research Institute of Guizhou Province， Xingyi， Guizhou 562400）

Abstract In order to determine the optimization of HPLC determination method for β-carotene， the retention time and separation conditions of β-carotene extracted from tuberous roots of white cassava SC101 and yellow cassava SC9 were analyzed using acetone/petroleum ether （2/5， V/V） mixtures as extraction buffer and methanol/tert butyl methyl ether （70∶30） mixtures as mobile phase. Chromatography conditions were as follow： chromatographic column， YCM C30； column temperature， 30℃； Isocratic flow rate， 1 mL/min. The results showed that the coefficient of variation regarding precision and reproducibility determining β-carotene contents in this method was less than 5%. The retention time for β-carotene determination was 12.7 min during this experiment. β-carotene within 2～30 μg/μL had a good linearity （y=209.11x-14.114，R2=0.999 3）. The average recovery was from 81% to 92%. In the present study，the measured data regarding β-carotene determination was stable. The analysis time for β-carotene determination in the experiment was at least less than 30min compared with the previous studies. It is suitable for the quantitative analysis of small amount β-carotene in cassava tuberous roots.

Keywords cassava； β-carotene； HPLC； quantitative analysis

木薯（Manihot esculenta Crantz） 是三大薯類作物之一，是世界上近8億人口的主糧[1-2]。類胡蘿卜素是人類所需的營(yíng)養(yǎng)成分之一，也是人體合成維生素A的前體。因此，木薯塊根中β-胡蘿卜素的含量成為衡量其營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的重要指標(biāo)，長(zhǎng)期食用含類胡蘿卜素低的木薯，會(huì)引起夜盲癥、干眼病、角膜軟化等癥狀[3-4]。據(jù)研究，深黃甜木薯的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值較高，其塊根中β-胡蘿卜素含量占總類胡蘿卜素含量的90%以上[5-6]。植物中類胡蘿卜素種類繁多，結(jié)構(gòu)復(fù)雜，理化性質(zhì)不穩(wěn)定，如采用傳統(tǒng)的分光光度法測(cè)量β-胡蘿卜素，數(shù)據(jù)線性范圍大，結(jié)果精確度差[7]。近幾年，國(guó)內(nèi)運(yùn)用高效液相色譜法（HPLC）對(duì)不同作物進(jìn)行β-胡蘿卜素分析測(cè)定，分離效果好，效率高，精確性和準(zhǔn)確度高。然而，不同作物的提取方法和不同檢測(cè)方法不盡相同，如甘薯[8-9]、油菜[10]和桃果實(shí)[11]等。

木薯中β-胡蘿卜素測(cè)定主要采用紫外分光光度法，其測(cè)量結(jié)果波動(dòng)性較大，準(zhǔn)確度和精密度較差[12-13]。Kimura等[14]用YMC C30色譜柱，流動(dòng)相為甲醇：叔丁基甲醚（80∶20，V/V），流速為0.8 mL/min，等度洗脫，對(duì)木薯β-胡蘿卜素進(jìn)行測(cè)定分析，分離效果好、線性關(guān)系好，數(shù)據(jù)準(zhǔn)確可靠，但其檢測(cè)時(shí)間較長(zhǎng)，不能在短時(shí)間內(nèi)批量測(cè)定木薯中β-胡蘿卜素含量。本研究在Lucia等[15]方法的基礎(chǔ)上進(jìn)行改進(jìn)，以期獲得高效測(cè)量木薯塊根β-胡蘿卜素的分析方法。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)材料與試劑

選取種植在中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶作物品種資源研究所國(guó)家木薯種質(zhì)資源圃8個(gè)月的白心木薯SC101和蛋黃木薯SC9塊根為實(shí)驗(yàn)材料。

甲醇（色譜純）、叔丁基甲醚（色譜純），購(gòu)自Sigma公司；丙酮：分析純，購(gòu)自廣州化學(xué)試劑廠；β-胡蘿卜素標(biāo)準(zhǔn)品：美國(guó) Sigma 公司。

1.1.2 儀器

Agilent 1260 型高效液相色譜系統(tǒng)（配有可變波長(zhǎng)紫外檢測(cè)器）：美國(guó)Agilent公司；色譜數(shù)據(jù)處理由 Agilent 1260 LC 軟件完成；氮吹儀（NDK200-2）、渦混儀（QL-861）等。

1.2 方法

1.2.1 β-胡蘿卜素提取

木薯塊根β-胡蘿卜素提取參照Kimura[14]、Lucia[15]、GB/T5009.83-2003食品類胡蘿卜素提取方法[16]和甘薯β-胡蘿卜素提取方法[8，17]，并做適當(dāng)改進(jìn)。木薯塊根樣品經(jīng)清洗、晾干，薯皮和薯肉分開切碎混勻，用液氮凍干后研磨成細(xì)粉。稱取粉末（約1.0 g）轉(zhuǎn)入10 mL離心管，加入2 mL冷凍丙酮渦混后再加入2 mL冷凍石油醚，渦混，于4℃，3 000 r/min，離心5 min后取上清液轉(zhuǎn)入10 mL離心管。剩余殘?jiān)尤? mL石油醚，渦混、離心，重復(fù)提取3次，直至殘?jiān)優(yōu)闊o色。收集樣品液用弱氮?dú)獯蹈桑尤?00 μL丙酮溶解，一次性針筒收集溶解液，一次性濾膜（0.45 μm）過濾后收集樣品液置于棕色樣品瓶（含內(nèi)襯管），作為本實(shí)驗(yàn)的分析樣品。

1.2.2 β-胡蘿卜素HPLC分析

1.2.2.1 優(yōu)化方法

根據(jù)Kimura[14]、Lucia[15]、Carvalho等[18]對(duì)2種木薯品種塊根β-胡蘿卜素進(jìn)行HPLC分析，發(fā)現(xiàn)YCM C30色譜柱比C18柱子分離效果好，叔丁基甲醚為流動(dòng)相洗脫效果佳。不同色譜條件可以得到不同分析結(jié)果，為快速檢測(cè)木薯塊根β-胡蘿卜素，本研究在前人研究的基礎(chǔ)上，對(duì)色譜條件做以下改進(jìn)。色譜柱：YCM Carotenoid S-3 柱，4.6 mm ×250 mm，美國(guó) Waters 公司；柱溫：30℃；流動(dòng)相：色譜純，甲醇/叔丁基甲醚（70/30，V/V）等度洗脫；流速：1 mL/min；進(jìn)樣量：20 μL；測(cè)定波長(zhǎng)：450 nm。

1.2.2.2 β-胡蘿卜素標(biāo)準(zhǔn)品制備和標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

精確稱取β-胡蘿卜素標(biāo)準(zhǔn)品 125 mg，置于250 mL 棕色容量瓶，丙酮溶解并定容至250 mL，作為標(biāo)準(zhǔn)母液（濃度500 μg/mL）。用丙酮將母液分別稀釋成2、5、10、15、30 μg/mL。以峰面積（y）對(duì)標(biāo)準(zhǔn)品濃度（x）進(jìn)行線性回歸分析，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.3 β-胡蘿卜素含量測(cè)定方法確立

1.2.3.1 精確度測(cè)定

同一β-胡蘿卜素標(biāo)準(zhǔn)品溶液（10 μg/mL）連續(xù)測(cè)定10次，并記錄β-胡蘿卜素保留時(shí)間（Rt）和吸收峰面積（mAU·s），計(jì)算平均值及變異系數(shù)（CV）。

1.2.3.2 重復(fù)性及樣品穩(wěn)定性測(cè)定

樣品重復(fù)性檢測(cè)選取蛋黃木薯SC9塊根肉樣品，按1.2.1 的方法制備 6 份樣品測(cè)定溶液，樣品進(jìn)樣量設(shè)定為20 μL進(jìn)行色譜測(cè)定。樣品穩(wěn)定性檢測(cè)時(shí)，選取樣品分別在制備后0、4、8、12、24 h進(jìn)樣測(cè)定，記錄β-胡蘿卜素的保留時(shí)間和吸收峰面積，計(jì)算其平均值及變異系數(shù)。

1.2.3.3 加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)

按加標(biāo)回收率要求，在已知含量的木薯塊根樣品中加入3個(gè)濃度水平（5、10、15 μg/mL）的標(biāo)準(zhǔn)液，測(cè)定其回收率。

1.2.3.4 樣品β-胡蘿卜素含量的測(cè)定

分別提取白心木薯SC101和蛋黃木薯SC9塊根薯皮和薯肉的β-胡蘿卜素，每個(gè)樣品3次重復(fù)。采用HPLC優(yōu)化方法獲得β-胡蘿卜素峰面積，利用以下公式計(jì)算樣品β-胡蘿卜素含量，結(jié)果以平均值（±）標(biāo)準(zhǔn)誤表示。計(jì)算公式為：

C（μg/g）=

式中：C為樣品β-胡蘿卜素含量（μg/g）；Ax為樣品峰面積；Cs為標(biāo)準(zhǔn)品濃度（μg/mL）；V為樣品定容體積（mL）；As為標(biāo)準(zhǔn)品峰面積；P（g）為樣品質(zhì)量。

1.2.4 統(tǒng)計(jì)分析

采用Excel 2013和DPS v7.05軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，差異顯著性標(biāo)準(zhǔn)采用鄧肯氏新復(fù)極差法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 β-胡蘿卜素標(biāo)準(zhǔn)曲線制定

β-胡蘿卜素標(biāo)樣的標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1。采用一元線性回歸法得峰面積積分值（y）與β-胡蘿卜素（x）之間的回歸方程為：y=209.11x-14.114 （R2=0.999 3）。結(jié)果表明，在2～30 μg/mL范圍內(nèi)，β-胡蘿卜素與峰面積的線性關(guān)系良好。因此，該曲線可作為HPLC法測(cè)定微量β-胡蘿卜素含量的標(biāo)準(zhǔn)。

2.2 HPLC精確度和重復(fù)性分析

為檢測(cè)該方法的精確度和可重復(fù)性，取20 μL標(biāo)準(zhǔn)溶液（10 μg/mL），連續(xù)10次重復(fù)進(jìn)樣，測(cè)定保留時(shí)間和吸收峰面積。β-胡蘿卜素的保留時(shí)間和峰面積如表1所示，β-胡蘿卜素的保留時(shí)間12.73 min，平均值變異系數(shù)為0.40，峰面積平均值2 212.56 mAU·s，變異系數(shù)為1.23，均小于5。β-胡蘿卜素濃度平均值10.65 μg/mL，變異系數(shù)1.22，小于5。說明此檢測(cè)方法結(jié)果準(zhǔn)確可靠，HPLC的精確度高，符合實(shí)驗(yàn)要求。

對(duì)SC9木薯塊根肉樣品進(jìn)行6次重復(fù)檢測(cè)，結(jié)果如表2所示，β-胡蘿卜素的平均保留時(shí)間12.65 min，變異系數(shù)為0.47，峰面積平均值521.00 mAU·s，變異系數(shù)為4.4，β-胡蘿卜素濃度平均值2.56 μg/mL，變異系數(shù)4.68，均小于5。表明本方法重復(fù)性好。

2.3 液相色譜圖線性范圍

β-胡蘿卜素標(biāo)準(zhǔn)品（20 μg/mL）經(jīng)HPLC分離，用波長(zhǎng)為450 nm的紫外光譜掃描得到紫外光譜圖，β-胡蘿卜素保留時(shí)間為12.65 min（圖2A）。蛋黃木薯SC9和白心木薯SC101塊根薯肉樣品經(jīng)HPLC分離后均獲得β-胡蘿卜素的紫外光譜圖（圖2B、2C），保留時(shí)間均為12.65 min，但SC9塊根肉的色譜峰面積遠(yuǎn)大于SC101。

2.4 樣品穩(wěn)定性分析

以SC9塊根薯肉作為樣品檢測(cè)該方法的穩(wěn)定性，于樣品制備后0、4 、8、12、24 h后進(jìn)樣測(cè)定。通過對(duì)提取樣品后不同時(shí)間段進(jìn)樣檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，β-胡蘿卜素保留時(shí)間平均為12.61 min，變異系數(shù)為0.22，峰面積平均為475.37 mAU·s，變異系數(shù)為8.03，β-胡蘿卜素濃度平均值2.34 μg/mL，變異系數(shù)7.69，均小于10，說明樣品在24 h內(nèi)符合檢測(cè)要求。隨著時(shí)間延長(zhǎng)，樣品峰面積呈遞增趨勢(shì)（表3）。

2.5 回收率測(cè)定

在已知含量樣品中，加入3個(gè)濃度水平的標(biāo)準(zhǔn)液測(cè)定其加標(biāo)回收率，結(jié)果見表4。3個(gè)濃度水平的標(biāo)準(zhǔn)液平均回收率分別為87.7%、80.7%和92.1%；對(duì)應(yīng)變異系數(shù)分別為3.19、2.04和1.20，全部均小于5，表明該檢測(cè)方法回收率良好。

2.6 樣品β-胡蘿卜素含量測(cè)定

白心木薯SC101和蛋黃木薯SC9塊根薯皮和薯肉β-胡蘿卜素含量測(cè)定結(jié)果見表5?？梢钥闯?，SC101塊根薯皮和薯肉β-胡蘿卜素含量較低，且差異不顯著；蛋黃木薯SC9塊根薯肉β-胡蘿卜素含量是薯皮的2倍，且差異顯著；與白心木薯相比，蛋黃SC9塊根薯肉β-胡蘿卜素含量是SC101的7倍。

3 討論與結(jié)論

β-胡蘿卜素的HPLC測(cè)定分析方法因其具有高柱效、高選擇性、高靈敏度、用樣量少、可重復(fù)、分析速度快等優(yōu)點(diǎn)，被國(guó)內(nèi)外研究者作為分析β-胡蘿卜素含量的首選[19]。木薯塊根中β-胡蘿卜素的HPLC測(cè)定分析方法前人已有研究（表6），方法一用C18柱，流動(dòng)相為乙腈∶甲醇∶乙酸乙酯（80∶10∶10，V/V/V），流速為0.7 mL/min，HPLC檢測(cè)時(shí)間比方法二和方法三短，但分離效果較差。方法二與方法三采用YCM C30柱，流動(dòng)相為甲醇∶叔丁基甲醚（80∶20，V/V），流速為0.8 mL/min，樣品分離效果好，但HPLC檢測(cè)時(shí)間較長(zhǎng)。本研究根據(jù)上述3種檢測(cè)方法進(jìn)行改進(jìn)：流動(dòng)相為甲醇∶叔丁基甲醚（70∶30，v/v），流速為1.0 mL/min。結(jié)果顯示，改進(jìn)方法保留時(shí)間為12.65 min左右，縮短了分析時(shí)間，分離效果佳，精確度高，重復(fù)性好，能夠滿足快速檢測(cè)木薯塊根β-胡蘿卜素含量的要求。

目前中國(guó)食品中β-胡蘿卜素含量的檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)也采用HPLC法[7]，雖然能使類胡蘿卜素分離好，但樣品處理前需經(jīng)氧化鋁過濾層析，比較繁瑣，分析時(shí)間長(zhǎng)，耗時(shí)50 min（未發(fā)表數(shù)據(jù)）。在木薯β-胡蘿卜素分析過程中，Kimura[14]和Lucia[15]均采用丙酮做提取液，提取樣品雖然過程簡(jiǎn)單，但樣品分離純化步驟較復(fù)雜，分析時(shí)間較長(zhǎng)，樣品穩(wěn)定性差。采用本研究的改進(jìn)方法進(jìn)行檢測(cè)，樣品前處理簡(jiǎn)單快速，操作容易，回收率范圍在80.7%～92.1%。在0～24 h內(nèi)，樣品重復(fù)性和穩(wěn)定性均滿足檢測(cè)要求。利用該方法對(duì)白心木薯SC101和黃心SC9塊根中β-胡蘿卜素含量進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示，黃心木薯塊根薯皮和薯肉β-胡蘿卜素含量遠(yuǎn)高于白心木薯，為木薯食用品種的篩選提供理論依據(jù)。

參考文獻(xiàn)

[1] 林 雄，李開綿. 海南島木薯種質(zhì)資源考察報(bào)告[A]. 華南熱帶作物科學(xué)研究院，中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物品種資源研究所，海南島作物（植物）種質(zhì)資源考察文集[C]. 北京：農(nóng)業(yè)出版社，1992：33-38.

[2] Li K， Zhu W， Zeng K， et al. Proteome Characterization of cassava （Manihot esculenta Crantz） somatic embryos， plantlets and tuberous roots[J]. Proteome Science，2010，1477-5956-8-10.

[3] Anonymous. Report of a Joint WHO/FAO/UNU expert consultation： Protein and amino acid requirements in human health [R]. in WHO Technical Report Series， 2007.

[4] Stephenson K， Amthor R， Mallowa S， et al. Consuming cassava as a staple food places children 2-5 years old at risk for inadequate protein intake，an observational study in Kenya and Nigeria [J]. Nutrition Journal， 2010， 1475-2891-9-9.

[5] Iglesias C， Mayer J， Cha′vez AL，et al. Genetic potential and stability of carotene content in cassava roots [J]. Euphytica，1997， 94： 367-373.

[6] Ortega-Flores C I， Lopes da Costa M A， Cereda P，et al. Bioavailabilty of β-carotene in dehydrated yellow cassava （Manihot esculenta Crantz）. La biodisponibilidad de β-caroteno en yuca deshidratada hojas （Manihot esculenta Crantz） [J]. Cie^nc Tecnol Alim， 2003， 23（3）： 473-477.

[7] 張英宣，張 莉. 胡蘿卜中類胡蘿卜素全量的測(cè)定[J]. 中國(guó)食物與營(yíng)養(yǎng)，2006，（6）：24-25.

[8] 秦宏偉，楊紅花，史春余，等. 甘薯中β-胡蘿卜素提取工藝研究[J]. 食品科學(xué)，2007，28（1）：123-125.

[9] 孫 健，彭宏祥，董新紅，等. 甘薯中β-胡蘿卜素HPLC測(cè)定方法分析[J]. 食品科技，2009，34（1）：236-239.

[10] 曾德志. 不同顏色油菜花瓣中主要類胡蘿卜素的含量及相關(guān)基因的表達(dá)分析[D]. 成都：四川農(nóng)業(yè)大學(xué)，2013.

[11] 顏少賓. 桃果實(shí)發(fā)育階段類胡蘿卜素的變化分析[D]. 南京：南京農(nóng)業(yè)大學(xué)，2012.

[12] 簡(jiǎn)純平. 采后木薯塊根貯存能力及蛋白質(zhì)組學(xué)分析 [D]. ?？冢汉Ｄ洗髮W(xué)，2012.

[13] 徐 娟，黃 潔. 6份木薯種質(zhì)營(yíng)養(yǎng)成分與食味的初步分析及評(píng)價(jià)[J]. 熱帶作物學(xué)報(bào)，2013，34（1）：373-376.

[14] Kimura M， Cintia N， Delia B， et al. Screening and HPLC methods for carotenoids in sweet potato，cassava and maize for plant breeding trials[J]. Food Chemistry， 2007， 100： 1 734-1 746.

[15] Lucia M， Alcides R， Ronoel L， et al. Retention of total carotenoid and β-carotene in yellow sweet cassava （Manihot esculenta Crantz） after domestic cooking [J]. Food & Nutrition Research，2012， 56：15 788.

[16] G B/T5009.83- 2003，食品中胡蘿卜素的測(cè)定[S].

[17] 吳 鑫，楊柳樺，曾 果，等. 高效液相色譜法測(cè)定甘薯中β-胡蘿卜素[M]. 中國(guó)衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志，2006，16（9）：1 056-1 058.

[18] Carvalho L， Lippolis J， Chen S， et al. Characterization of Carotenoid-protein Complexes and Gene Expression Analysis Associated with Carotenoid Sequestration in Pigmented Cassava （Manihot esculenta Crantz） Storage Root[J]. The Open Biochemistry Journal， 2012， 6： 116-130.

[19] 莫玉楠，張魯剛，王國(guó)芳. 橙色大白菜類胡蘿卜素提取與測(cè)定方法研究[J]. 西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2014，42（3）：206-214.