四川小麥品種抗條銹基因的SSR分析

康曉慧，彭玉姣，付菊梅，白　雪，張春容，蔚慧欣

(西南科技大學生命科學與工程學院，中國 綿陽　621010)

四川小麥品種抗條銹基因的SSR分析

康曉慧*，彭玉姣，付菊梅，白雪，張春容，蔚慧欣

(西南科技大學生命科學與工程學院，中國 綿陽621010)

摘要從46對小麥基因組SSR引物中，篩選出帶型清晰、穩定、多態性豐富的引物11對．利用該11對引物對52份抗病材料進行了遺傳多樣分析．結果表明，11對SSR引物共擴增出66個多態性位點，其中，每對SSR有1～10個，平均為6個．位點多態性指數(PIC)為0.75～0.90，平均為0.84．UPGMA聚類分析表明，SSR標記可將52份抗病品種分為3大類7個亞類．本研究對抗條銹基因功能分析及小麥抗條銹病分子輔助育種有參考價值．

關鍵詞小麥；抗病基因；條銹菌；SSR

The SSR Analysis of Resistance Gene to

Stripe Rust in Sichuan Wheat Varieties

KANGXiao-hui*,PENGYu-jiao,FUJu-mei,BAIXue,ZHANGChun-rong,YUHui-xin

(College of Life Science and Engineering, Southwest University of Science and Technology, Mianyang 621010, China)

Abstract11 pairs of SSR primer with clear, steady and obviously polymorphic bands were screened from 46 pairs of SSR primer in wheat genome. The genetic diversities of 52 wheat cultivars with stripe rust resistance were analyzed by using 11 SSR primer pairs. The results showed that 11 pairs of primer generated 66 polymorphic sites and each primer amplified 1 to 10 sites with a mean of 6. The polymorphism information content (PIC) of 11 pairs ranged from 0.75 to 0.90 with an average of 0.84. UPGMA cluster analysis indicated that the germplasms could be divided into 3 large groups and 7 cluster subgroups based on SSR markers. The research has some reference value for the function analysis of resistance genes to stripe rust and molecular marker assisted breeding.

Key wordswheat; resistance gene;Pucciniastriiformis; SSR

小麥條銹病是由條形柄銹菌(PucciniastriiformisWest.f.sp.tritici)引起的一種真菌性病害，給我國小麥生產造成嚴重的經濟損失．近年來，四川麥區小麥條銹病每年都處于高發狀態，造成每年3 Mt以上的糧食損失[1]．國內外的研究表明，選育抗病品種是控制小麥條銹病最經濟、有效和安全的途徑．傳統的育種方法周期長、工作量大、人為選擇誤差大，而分子標記是從DNA水平進行鑒定，彌補了傳統育種方法的不足，大大加快了育種進程[2]．其中SSR標記是目前小麥研究中應用最為廣泛的一種DNA標記技術．本研究以52份四川小麥成株期抗銹品種為研究對象，利用小麥基因組中SSR標記對其從分子水平上進行遺傳多樣性分析，了解不同抗銹種質資源所攜帶抗銹基因的差異和抗銹種質資源之間的遺傳關系，為利用有效的抗銹種質資源培育優質新品種提供理論依據．

1材料與方法

1.1　試驗材料

將52份抗性材料(見表1)用于SSR遺傳多樣性分析.

表1　抗條銹性品種

1.2　試驗方法

1.2.1黃化苗的培養將成株期鑒定的52份抗病品種分別置于鋪有濕紗布的培養皿中，上面蓋紗布，于27 ℃恒溫培養箱中進行黑暗培養，每天早晚補足水分，待黃化苗長到兩片葉即可用于DNA的提取．

1.2.2小麥DNA的提取參照Rogers和Bendich(1985)[3]，Micheli等(1994)[4]的方法略改進．取100 mg新鮮小麥葉片，至液氮中研磨成粉末，加入預熱的CTAB裂解緩沖液，加入等體積的氯仿與異戊醇(V氯仿∶V異戊醇=24∶1)反復抽提．取上清液加入10 μL RNAase，37 ℃水浴30 min，氯仿與異戊醇(V氯仿∶V異戊醇=24∶1)抽提一次，取上清液加入0.1倍體積的3 mol/L NaAc和2倍體積的冰凍無水乙醇沉淀DNA，可見團狀DNA出現．將醋酸鈉倒出，室溫風干，然后加入100 μL 1XTE溶解，4 ℃保存備用．

1.2.3模板DNA的檢測采用超微量分光光度計測定DNA純度與濃度，讀取OD值．OD260/OD280值范圍在1.8～2.0最合適．再通過2%瓊脂糖凝膠電泳進一步檢測DNA純度，若電泳后出現弱帶或雜帶，則說明DNA可能降解，即提取的DNA質量不高；若電泳后只有一條帶明顯，拖尾現象不嚴重，則說明DNA質量較高．

1.2.4PCR擴增體系PCR具體反應體系：2×Taq PCR Mix 12.5 μL,ddH2O 6.5 μL,10 μmoL/L F.P 2 μL, 10 μmoL/L R.P 2 μL,20 mg/L DNA 2 μL.

PCR反應程序為：94 ℃預變性5 min，94 ℃變性1 min，50～61 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，共35個循環；最后72 ℃延伸10 min．擴增產物經聚丙烯酰胺凝膠電泳，染色顯影后統計譜帶．

1.2.5數據處理與分析品種間遺傳相似系數的計算參照Nei和Li[5]的方法；SSR擴增帶型采用“0”，“1”和“9”來統計，分別表示在相同遷移水平上“有帶”、“無帶”和“缺帶”；SSR引物的多態性信息指數(PIC)利用Senior等[6]提供的公式計算；利用NTSYS-PC 2.11[7]遺傳分析軟件進行數據處理．

2結果與分析

圖1　部分小麥DNA電泳圖Fig.1　The electrophoretogram of parts of wheat DNA

2.1　抗銹品種DNA提取結果

將52份抗銹品種分別提取DNA，于紫外分光光度計上檢測其純度，同時結合2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(圖1)，結果表明DNA的OD260/280在1.8～2.0之間，大部分結果顯示拖帶不太嚴重，適合下一步操作．

2.2　引物篩選

將52份抗銹品種對46對SSR引物進行篩選，從中選擇多態性較好和條帶清晰的11對引物(表2)．

2.3　SSR標記的多態性

利用表2中的11對引物對52份抗病品種進行分析，擴增結果條帶清晰、多態性豐富，共檢測到66個多態性位點，每對引物能檢測到1～10個，平均為6個，見表3.其中Xwmc656和Xbarc187有10個多態性位點，多態性位點最小的引物是Xwmc626，其有2個多態性位點．位點多態性指數(PIC)為0.75～0.90，平均為0.84，多態性指數最大的引物是Xwmc656，最小的是Xwmc626．

表3　SSR引物擴增結果

2.4　SSR標記揭示品種間的遺傳距離

根據SSR標記數據計算品種間的SSR遺傳相似系數(表4)，其變異范圍為0.524～0.976，平均為0.75．在這些品種中川07005與西科麥2號，渝03062與sw18155和內麥10號，內麥8號與川麥55遺傳相似性最高，相似系數為0.976；綿麥48和綿麥30，渝03062與綿麥48和綿麥30，綿麥41與綿麥48和綿麥30，西科1與綿麥367，綿麥31與331-60，綿麥41與綿麥46，內麥836與綿麥48和綿麥30的遺傳相似系數為0.952；川07005與川麥55， 渝03062與內麥12和內麥8號，綿麥41與川麥51，蜀麥375和川麥42與川麥47的遺傳相似系數為0.929；川06品09與渝03062，川06品09與西科麥5號，川06品09與川麥57，川麥54與內麥11，西科麥3號與川育23，內麥10號和內麥11與川麥53，內麥8號與川麥58，杏麥2號與渝03062，它們的遺傳相似系數為0.905；其他品種間的遺傳相似系數均小于0.9．

2.5　SSR遺傳揭示供試品種(系)間的遺傳關系

計算52份供試材料間的遺傳距離，并以離差平方和方法進行聚類分析，建立樹狀聚類圖(圖2)，52份材料在0.524水平上可分為三大類(表5)．

表4　基于SSR分析的52份抗病材料的遺傳相似性分析

圖2　52份四川小麥抗病品種聚類圖Fig.2　The clustering analysis of 52 Sichuan wheat cultivars

類群亞群品種名序號Ⅰ6ⅡⅠ40Ⅱ5,22,10Ⅲ1,2,3ⅢⅠ51,52,49,50,44,45,47,48,42,43,46,30,31Ⅱ36,37,12,27,28,9,32,33,29,34,35,16Ⅲ17,20,18,19,15,21,23,24,25,4,41,13,14,38,39,7,8,26,11

3討論

目前生產上推廣的小麥品種絕大部分是繁6及其衍生系，致使四川小麥品種遺傳基礎狹窄，難以抵御條銹菌新小種的入侵，從而導致小麥條銹病的多次流行，嚴重降低了小麥產量和品質．利用物種內的遺傳多樣性，選用親緣關系較遠的抗性品種作雜交親本，以此來培育高抗品種，是控制作物病害的一種有效的生態方法[8]．前人已利用同工酶、種子貯藏蛋白、醇溶蛋白等不同手段對四川地方小麥品種進行了遺傳多樣性研究，發現四川地方品種變異較小、遺傳多樣性較低[9-12]．陳玉清[13]、鄭有良[14]采用RAPD標記對四川近50年來的小麥品種間遺傳多樣性進行研究，結果顯示各年代間變化不一致，20世紀90年代后遺傳多樣性呈下降趨勢．

本研究利用SSR標記技術對52份四川抗病材料進行遺傳多樣分析．結果發現，川07005與西科麥2號、渝03062與sw18155和內麥10號、內麥8號與川麥55遺傳相似性最高，相似系數為0.976；川麥55與樂麥、331-60，sw2962與川育24、杏麥2號等相似系數最低，為0.524．聚類分析顯示，52份抗病品種在0.524水平上可分為三大類，渝03062與其余品種親緣關系較遠，川07005與內麥9號和綿麥40的親緣關系較近，川05觀08與川07005的親緣關系較近．從整體來看，各科研單位的小麥品種遺傳多樣性差異不大，與前人的研究結果一致．這可能與各科研單位選用有限的骨干親本抗源材料有關，也可能與長期演化過程中的天然雜交等因素有關．

參考文獻：

[1]李奇穗，田茂．眉山市小麥條銹病發病氣象因子及防治對策研究[J]．現代農業科技， 2012(6)：152-155．

[2]張文龍，陳志偉，楊文鵬，等．分子標記輔助選擇技術及其在作物育種上的應用研究[J]．種子， 2008，27(4)：39-43．

[3]ROGERS S O, BENDICH A J． Extraction of DNA from milligram amounts of fresh， herbarium and mummified plant tissues[J]．Plant Mol Biol， 1985，5(2)：69-76．

[4]MICHELI M R, BOVA R, PASCALE E,etal．Reproducible DNA fingerprinting with the random amplified polymorphic DNA (RAPD) method[J]．Nucleic Acids Res， 1994，22(10)：1921-1922．

[5]NEI M, LI W H. Mathematical model for studying genetic variation in terms of restriction endonucleases[J]. Proc National Academy Sci， 1979，76(10)：5269-5273．

[6]SENIOR M L, MURPHY J P, GOODMAN M M,etal．Utility of SSRs for determining genetic similarities an relationships in maize using an agarose gel system[J]．Crop Sci， 1998，38(4)：1088-1098．

[7]ROHLF F J．NTSYS-pc：numerical taxonomy and multivariate analysis system[M]．New York: Applied Biostatistics， 1992．

[8]WAN A M， ZHAO Z H， CHEN X M，etal．Wheat stripe rust epidemic and virulence ofPucciniastriiformisf.sp.triticiin China in 2002[J]．Plant Dis， 2004，88(8)：896-904．

[9]楊作民，解超杰，孫其信．后條中32時期我國小麥條銹抗源之現狀[J]．作物學報， 2003，29(2)：161-168．

[10]楊祖俐，羅明誠，顏濟．四川小麥地方品種的酯酶與過氧化物酶同工酶研究[J]．四川農業大學學報， 1992，10(1)：105-112．

[11]魏育明，鄭有良，劉登才，等．四川小麥地方品種Gli-1、Gli-2和Glu-1位點的遺傳多樣性[J]．植物學報， 2000，42(5)：496-501．

[12]WEI Y M， ZHENG Y L， LIU D C，etal．Gliadin and HMW-glutenin variations inTriticumturgidumL．ssp．turgidumandT.aestivumL．landraces native to Sichuan， China[J]．Wheat Infor Serv， 2000(90)：13-20．

[13]陳玉清，鄭有良，魏育明．四川主栽小麥RAPD標記遺傳差異研究[J]．四川農業大學學報， 1999，17(4)：354-361．

[14]鄭有良，陳玉清，魏育明，等．四川主栽小麥品種遺傳多樣性研究[C]∥北京：21世紀小麥遺傳育種展望—小麥遺傳育種國際學術討論會文集， 2001：363-368．

(編輯王健)

*通訊作者,E-mail：xhuik09@126.com

基金項目：公益性行業(農業)科研專項資助項目(200903035)

收稿日期：2014-11-14

中圖分類號S432.1

文獻標識碼A

文章編號1000-2537(2015)03-0011-05

DOI:10.7612/j.issn.1000-2537.2015.03.003