ABA對匍枝筋骨草防御酶活性及蛻皮激素合成的影響

楊月月，遲德富，宇　佳

(東北林業大學林學院，中國 哈爾濱　150040)

ABA對匍枝筋骨草防御酶活性及蛻皮激素合成的影響

楊月月，遲德富*，宇佳

(東北林業大學林學院，中國 哈爾濱150040)

摘要向培養了7 d的匍枝筋骨草懸浮細胞培養體系內分別添加0.1,0.2,0.3,0.4,0.5 mg/L的ABA，以研究ABA對匍枝筋骨草細胞防御系統的作用及ABA對蛻皮激素合成的影響．試驗結果表明：向培養7 d的懸浮體系中，添加0.1~0.4 mg/L的ABA后，懸浮細胞第4天出現褐化；添加0.5 mg/L的ABA后，第3天出現懸浮細胞褐化現象；添加不同質量濃度的ABA后第4天測其懸浮細胞生長量均與對照差異不顯著；添加不同質量濃度ABA后懸浮細胞的SOD，POD 和CAT活性在48 h內均顯著上升，而PAL活性變化在2~24 h間不顯著，后上升；添加不同質量濃度的ABA可使筋骨草懸浮細胞的蛻皮激素含量增高，而添加0.1 mg/L ABA，其蛻皮激素含量增高最為顯著．

關鍵詞匍枝筋骨草；β-蛻皮甾酮；ABA；抗氧化酶

Changing of Antioxidant Enzyme Activities andβ-Ecdysone Synthesis after

Adding ABA intoAjugaLobataD. Don Suspension Cell Cultures System

YANYYue-yue,CHIDe-fu*,YUJia

(School of Forestry, Northeast Forestry University, Harbin 150040, China)

AbstractThis study focuses on theAjugalobataD.Don suspension cell culture system after being cultivated for 7 days. In order to study the effect of ABA to the cell defense andβ-ecdysone synthesis ofAjugalobataD.Don suspension cell culture system, five kinds of different concentration ABA from 0.1 to 0.5 mg/L were added to this system separately. The results show that theAjugalobataD.Don suspension cell became brown 4 days after addition of ABA from 0.1 to 0.4 mg/L. The cell became brown 3 days after attition of ABA with 0.5 mg/L. No matter what kinds of ABA were added, the suspension cell growing in the treated culture system have no significant difference compared with controls when observed on the 4th day. No matter what kinds of ABA were added, the activities of SOD, POD and CAT increase when observed during the 48 hours, while the activities of PAL does not change remarkably during 2 to 24 hours, but increase after 24 hours. No matter what kinds of ABA were added, the synthesis ofβ-ecdysone increase, but the change increases most significantly when 0.1mg/L ABA was added.

Key wordsAjugalobataD. Don;β-ecdysone; ABA; antioxidant enzyme

筋骨草，唇形目(Lamiales)唇形科(Lamiaceae)筋骨草屬(Ajuga)植物,一年或二年生草本，高10～30 cm,原產歐亞大陸[1]，我國南方地區主產．筋骨草的主要次生代謝物為脫皮甾酮、杯莧甾酮、筋骨草甾酮B和C、筋骨草糖、筋骨草內酯、黃酮甙、皂甙及生物堿等[2]．國內外對匍枝筋骨草的研究主要集中在醫藥與昆蟲方面．在醫藥上匍枝筋骨草具有清熱解毒，涼血平肝的作用．用于治療上呼吸道感染，扁桃體炎，支氣管炎，咽炎，肺炎，胃腸炎，肝炎，闌尾炎，高血壓等；外用可治跌打損傷，癰癤瘡瘍[3]．在害蟲控制方面，匍枝筋骨草蛻皮激素含量較高，提取的植物源蛻皮激素具有良好的殺蟲效果[4]，可用于植物源殺蟲劑和生長調節劑的制作，具有經濟和環境保護的價值．

脫落酸(Abscisic Acid，ABA)是一類抑制生長，促進植物休眠的植物激素，又稱S-誘抗素，也有“逆境激素”之稱[5]．將ABA加入細胞培養體系后，會介導植物細胞依次發生信號識別、信號轉導等生理生化水平的變化[6]，在逆境條件下ABA含量增高，提高植物抗性．在體系中添加ABA，ABA含量也會增高．近年研究發現，逆境條件下ABA在植物細胞培養生產次生代謝物中具有調控作用，可以誘導綠原酸、酚類、黃酮類和萜類物質的增加[7]．但ABA直接誘導細胞次生代謝產物卻未見報道．

ABA是一種對人畜無害，新型高效，天然的植物生長活性物質．本文在匍枝筋骨草懸浮體系中研究ABA對匍枝筋骨草細胞防御系統的作用及對蛻皮激素合成的影響，為揭示ABA調控筋骨草懸浮細胞合成蛻皮激素的機制奠定基礎．

1試驗與方法

1.1　試驗材料

試驗選取東北林業大學生命科學學院森林生物工程實驗室培養的懸浮匍枝筋骨草進行繼代培養．

1.2　方法

1.2.1懸浮細胞的培養采用趙曉杰等[8]方法．將筋骨草在固體培養基(MS+2,4-D 0.4 mg/L)上誘導成愈傷組織．將生長在固體培養基的愈傷組織，在無菌條件下接種到未添加瓊脂的液體培養基內(MS+2,4-D 0.4 mg/L)進行懸浮培養，接種量為100 g/L(即每50 mL培養基中接種筋骨草細胞鮮重5 g)，pH調至6.0．每隔7 d進行一次繼代．本實驗使用繼代次數為4代的懸浮體系．培養條件：培養室內光照培養，溫度為25 ℃，光/暗周期：16 h/8 h，光照強度2 000 lux，濕度為70%．搖床速度：110~120 r/min．

1.2.2篩選ABA濃度閾值本實驗設定0.1,0.2,0.3,0.4,0.5 mg/L共5個ABA質量濃度梯度，并以空白為對照．加入到接種量為100 g/L已培養7 d的懸浮體系中．觀察匍枝筋骨草在不同懸浮體系中生長狀態和生物量，根據培養結果，選出最適合的ABA添加濃度．

1.2.3 防御酶的提取及活性測定

(1)SOD提取與活性測定采用南京建成生物公司提供的總SOD測試盒進行提取，稱取植物組織1 g，加入9 mL 0.1 mol/L pH 7.0~7.4的磷酸緩沖液，制成100 g/L的勻漿液，3 500~4 000 r/min離心10 min，取上清液進行測定．以每1 g組織在1 mL反應液SOD抑制率達到50%時所對應的SOD量為一個SOD活力單位．

(2)CAT提取與活性測定采用總CAT測試盒(南京建成生物公司)提取,稱取植物組織1 g，加入9 mL生理鹽水，制成100 g/L的勻漿液，2 500 r/min離心10 min，取上清液進行測定．以每1 mg組織蛋白每秒鐘分解1 μmol H2O2的量為一個活力單位．

(3)POD提取與活性測定采用總POD測試盒(南京建成生物公司)提取，稱取植物組織1 g，加入9 mL 0.1 mol/L pH 7.0~7.4的磷酸緩沖液，制成100 g/L的勻漿液，3 500 r/min離心10 min，取上清液進行測定．以每1 mg組織蛋白每分鐘分解1 μg底物的酶量為一個活力單位．

(4)PAL提取與活性測定參照李靖[9]等的方法測定．取1 g(鮮質量)懸浮細胞，加入少量 PVP和石英砂，4 ℃下研磨，加入5 mL預冷的酶提取液(0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液 pH 6.0，含2 mmol/L EDTA，4 mmol/L DTT)勻漿，混勻后10 000 r/min 4 ℃離心15 min，上清為胞內酶待測液．1 mL酶待測液(同時以1 mL蒸餾水為對照)，加入2 mL 0.01 mol/L且pH 8.8 的硼酸緩沖液，1 mL 0.02 mol/L苯丙氨酸，混勻，37 ℃保溫30 min后，加入0.2 mL鹽酸終止反應．測定290 nm處的吸光值．以每分鐘吸光值增加 0.01所需酶量為1個酶活性單位(U)．

1.2.4β-蛻皮甾酮的提取及含量測定參照黎昕等[10]方法，匍枝筋骨草細胞(干質量)0.2 g，色譜甲醇5 mL，浸泡24 h，超聲1 h后進行微波消解(WT-8000消解條件：T：50 ℃，P：2P0，t：10 min，W：300×2)；有機過濾膜過濾后濾液直接用于HPLC檢測．蛻皮甾酮檢測色譜柱:C18(4.6 mm×250 mm,5 μm粒度)；紫外可見光檢測器(波長范圍190~800 nm)；檢測波長242 nm；流動相(V(甲醛)∶V(水)=1∶1)0.8 mL/min，進樣量20 μL．配置質量濃度為0.8，0.4，0.2,0.1,0.05 g/L的β-蛻皮甾酮標準品溶液，每次分別進樣10 μL，重復3次，以峰面積的平均值為縱坐標，質量濃度為橫坐標，得β-蛻皮甾酮回歸方程為：y=18 498x+226.2,相關系數為 0.999．按照液相色譜檢測的試樣的峰面積，由標準曲線求出β-蛻皮甾酮含量．圖1為蛻皮激素標樣液相色譜圖，圖2為匍枝筋骨草樣品液相色譜圖.

圖1　蛻皮激素標品液相色譜圖Fig.1　The HPLC chromatogram of β-ecdysone

圖2　樣品液相色譜圖Fig.2　The HPLC chromatogram of sample

2結果與分析

2.1　匍枝筋骨草懸浮培養體系的建立

將匍枝筋骨草苗接種到固體培養基中(MS+2,4-D 0.4 mg/L)，經30 d誘導，得到黃色疏松的愈傷組織(圖3，彩圖見封三)，將所得的愈傷組織接種到固體培養基(MS+2,4-D 0.4 mg/L)中進行繼代培養．再將愈傷組織接種到未加瓊脂的液體培養基中(MS+2,4-D 0.4 mg/L)進行懸浮培養，得到組織均一且松散的懸浮細胞．

圖3　匍枝筋骨草(a:幼苗;b:愈傷組織;c:懸浮細胞)Fig.3　Ajuga lobata D.Don (a: Seedling; b: Callus; c: Suspension cell)

2.2　ABA濃度閾值的篩選

向培養7 d后的懸浮體系分別加入0.1，0.2，0.3，0.4，0.5 mg/L ABA，培養3 d后0.1~0.4 mg/L ABA處理的懸浮細胞無明顯變化，0.5 mg/L ABA處理的細胞出現明顯褐化．第4天，所有濃度組均出現褐化現象(圖4，彩圖見封三)．

圖4　經ABA處理后生長狀況Fig.4　The growth status after ABA treatment

經ABA處理并培養4 d后測其鮮質量(見圖5)，添加ABA后生物量與對照差異不顯著．綜合分析其褐化現象及生物量變化，認定0.5 mg/L ABA不適宜匍枝筋骨草懸浮細胞生長．初步確定ABA添加范圍為0.1~0.4 mg/L．

2.3　防御酶的含量變化

2.3.1SOD的活性變化如圖6，ABA處理后2 h處理組與對照差異均不顯著，0.3~0.4 mg/L ABA處理的懸浮細胞6 h后SOD活性與對照差異顯著(P<0.05)．0.2~0.4 mg/L ABA處理的懸浮細胞12 h后SOD活性與對照差異顯著(P<0.05)．0.1 mg/L ABA處理24 h后與對照差異顯著，同時0.2~0.4 mg/L處理與對照差異極顯著(P<0.01)．48 h后所有濃度處理與對照差異極顯著(P<0.01)．SOD活性呈上升的趨勢，前12 h上升趨勢緩慢，12~24 h上升趨勢顯著，24~48 h后相對接近平穩．

圖5　細胞生物量變化Fig.5　The cell biomass variation

注：*，差異顯著；**，差異極顯著．下同.圖6　SOD活性變化Fig.6　The changes of SOD activity

2.3.2CAT的活性變化如圖7，ABA處理2 h后處理組與對照差異均不顯著，0.2~0.4 mg/L ABA處理的懸浮細胞6 h后CAT活性與對照差異顯著(P<0.05)．0.2~0.4 mg/L ABA處理的懸浮細胞12 h與24 h后CAT活性與對照差異極顯著(P<0.01)．48 h后所有濃度處理與對照差異極顯著(P<0.01)，且0.2~0.4 mg/L ABA處理后CAT活性相對接近．不同濃度ABA處理的筋骨草懸浮細胞CAT活性呈上升的趨勢．

2.3.3POD的活性變化如圖8，ABA處理2 h后處理組與對照差異均不顯著，0.2~0.4 mg/L ABA處理的懸浮細胞6~12 h后POD活性與對照差異極顯著(P<0.01)．48 h后所有濃度處理與對照差異極顯著(P<0.01)．不同濃度ABA處理的筋骨草懸浮細胞POD活性呈上升的趨勢，6~24 h上升趨勢緩慢，24~48 h后上升較快．

圖7　CAT活性變化Fig.7　The changes of CAT activity

圖8　POD活性變化Fig.8　The changes of POD activity

2.3.4PAL的活性變化如圖9，不同質量濃度ABA處理的筋骨草PAL活性變化趨勢不明顯．48 h前所有濃度處理均與對照差異不顯著．48 h時0.3~0.4 mg/L ABA處理懸浮細胞PAL活性與對照差異顯著(P<0.05)．

2.4　β-蛻皮甾酮的含量變化

如圖10， 0.1 mg/L ABA處理后蛻皮甾酮含量在12~48 h后與對照差異極顯著(P<0.01),呈上升趨勢．0.2 mg/L ABA處理12 h后與對照差異顯著(P<0.05)．其他各處理在各時間點蛻皮激素含量均與對照差異不顯著．

圖9　PAL活性變化Fig.9　The changes of PAL activity

圖10　蛻皮激素含量變化Fig.10　The changes of β-ecdysone contents

3結論

本研究在匍枝筋骨草懸浮系統建立的系統上，向已培養7 d的懸浮體系內加入0.1~0.5 mg/L ABA,結果表明:加入ABA后，匍枝筋骨草懸浮細胞的生物量與對照相比無顯著變化，未能證明ABA有效地促進懸浮細胞的增殖．同時發現，在加入4 d后，處理組懸浮細胞普遍出現了褐化現象，證明0.1~0.5 mg/L ABA不適宜用于葡枝筋骨草細胞的長期懸浮培養．

添加ABA后匍枝筋骨草細胞中SOD，CAT和POD活性呈上升趨勢，證明匍枝筋骨草在0.1~0.5 mg/L ABA處理后，懸浮細胞啟動了其防御系統，但PAL變化趨勢不如SOD，CAT和POD活性變化明顯；同時發現，在匍枝筋骨草懸浮培養細胞未褐化時間段內，添加0.1 mg/L ABA，懸浮細胞的蛻皮激素含量明顯增加，24 h后達到最大值，而后開始降低．匍枝筋骨草做為植物源殺蟲劑蛻皮激素的來源，可在生產前添加ABA以增加其蛻皮激素產量，得到高產蛻皮激素．

4討論

ABA處理后匍枝筋骨草懸浮細胞發生褐化，并隨濃度的增大其褐化現象愈明顯，這主要是因為ABA具有抑制生長作用, 可抑制整株植物或離體器官的生長，引起器官細胞早衰[11]．

SOD，CAT與POD是細胞防御酶，參與體內重要的生理活動,在受到抗機械損傷、抗病原物侵入、生長條件惡化等，這些酶的活性會增高，增加機體抵御外界逆境的能力[12]．本實驗中，經不同濃度ABA處理的葡枝筋骨草懸浮細胞內SOD，CAT以及POD活性均顯著高于對照，說明添加ABA后懸浮細胞啟動了其防御系統．分析其原因，初步認為ABA為調控激素，除介導細胞依次發生信號識別和傳導等，對植物細胞也有一定的脅迫作用[13-15]．因此，ABA加入到懸浮細胞培養體系后，誘使匍枝筋骨草懸浮細胞啟動防御系統，導致防御酶的活性增高；PAL是苯胺烷類代謝的關鍵酶，參與細胞分化和木質化過程并在植物抗逆過程中起作用[16]．但ABA處理后的匍枝筋骨草懸浮細胞中的PAL在2~24 h變化不十分顯著，而后出現了顯著的升高過程，這一現象與其他植物研究[17-20]現象一致．

ABA被稱為應激激素和脅迫激素，有研究表明，逆境條件可以影響細胞發生生理生化水平上的變化，在某種逆境脅迫下，植物細胞某些代謝加快，從而提高一些次生代謝物產量[21]，這可能是匍枝筋骨草懸浮細胞在添加0.1 mg/L的ABA后出現蛻皮激素合成量增高的原因．

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(編輯王健)

*通訊作者,E-mail：chidefu@126.com

基金項目：國家自然科學基金資助項目(31370649)

收稿日期：2014-10-24

中圖分類號S567.239

文獻標識碼A

文章編號1000-2537(2015)03-0016-06

DOI:10.7612/j.issn.1000-2537.2015.03.004