HPLC法同時(shí)測(cè)定灌胃補(bǔ)腎通絡(luò)方大鼠血漿中馬錢苷、阿魏酸和二苯乙烯苷含量

黃　攀，劉湘丹，馬　銘，盧岳華

(1. 湖南師范大學(xué)化學(xué)生物學(xué)及中藥分析教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 中國(guó) 長(zhǎng)沙　410081； 2.湖南中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，中國(guó) 長(zhǎng)沙　410208)

HPLC法同時(shí)測(cè)定灌胃補(bǔ)腎通絡(luò)方大鼠血漿中馬錢苷、阿魏酸和二苯乙烯苷含量

黃攀1，劉湘丹2，馬銘1，盧岳華1*

(1. 湖南師范大學(xué)化學(xué)生物學(xué)及中藥分析教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 中國(guó) 長(zhǎng)沙410081； 2.湖南中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，中國(guó) 長(zhǎng)沙410208)

摘要目的：建立灌胃補(bǔ)腎通絡(luò)方大鼠血漿中馬錢苷、阿魏酸和二苯乙烯苷的含量測(cè)定方法． 方法：以甲醇-乙酸乙酯(V甲醇∶V乙酸乙酯=3∶1)提取處理血漿，氮?dú)獯蹈珊罅鲃?dòng)相復(fù)溶進(jìn)樣．色譜條件: Johnson spherigel C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動(dòng)相: 甲醇-0.01%乙酸水溶液，梯度洗脫；檢測(cè)波長(zhǎng): 馬錢苷為235 nm，阿魏酸和二苯乙烯苷為320 nm；流速: 1 mL/min；柱溫: 30 ℃；進(jìn)樣量: 10 μL． 結(jié)果：空白血漿中內(nèi)源性物質(zhì)不干擾樣品的測(cè)定．馬錢苷、阿魏酸和二苯乙烯苷分別在0.03~3.00，0.03~3.00和0.02~2.00 mg/L范圍內(nèi)均有良好的線性關(guān)系(r≥0.999) ，檢測(cè)限依次為0.020,0.015和0.010 mg/L；提取回收率分別大于79%、74%和58%，日間、日內(nèi)精密度(RSD)均分別小于10%,7.3%和9.7%．結(jié)論：所建立的含量測(cè)定方法操作簡(jiǎn)便，靈敏，準(zhǔn)確，適用于大鼠灌胃補(bǔ)腎通絡(luò)方后血漿中馬錢苷、阿魏酸和二苯乙烯苷的同時(shí)測(cè)定，為補(bǔ)腎通絡(luò)方中有效成分藥動(dòng)學(xué)研究提供參考．

關(guān)鍵詞補(bǔ)腎通絡(luò)方；馬錢苷；阿魏酸；二苯乙烯苷；血藥濃度；高效液相色譜法

Simultaneous Determination of Loganin, Ferulic Acid and Stilbene Glucoside

in Rat Plasma after Ig Administered with Bushen Tongluo Formula by HPLC

HUANGPan1,LIUXiang-Dan2,MAMing1,LUYue-Hua1*

( 1. Key Laboratory of Chemical Biology and Traditional Chinese Medicine Research, Ministry of Education of China,

Hunan Normal University, Changsha 410081, China;

2. Hunan University of Chinese Medicine, Changsha 410208, China)

AbstractObjectiveTo establish an HPLC method for extracting and determining the loganin, ferulic acid and stilbene glucoside in rat plasma after ig administered with Bushen Tongluo Formula. MethodsThe plasma was extracted and treated with a mixture of methanol and ethyl acetate (3∶1=V∶V), then plasma extract evaporated to dryness under a stream of nitrogen flow, and the residue was reconstituted in HPLC mobile phase to inject. The conditions of chromatography: the chromatographic separations was performed on Johnson spherigel C18column (250 mm×4.6 mm, 5 μm particle size) with a mobile phase composed of methanol-water (from 30∶70 to 50∶50,V/V) containing 0.01% glacial acetic acid at a flow of 1 mL/min. Loganin was determined at 235 nm, ferulic acid and stilbene glucoside were determined at 320 nm. The temperature of column was 30 ℃. The inject volume was 10 μL. ResultsThe method showed good linearity and no endogenous material interfered with the marked compounds. The linear range of loganin, ferulic acid and stilbene glucoside was 0.03~3.00,0.03~3.00 and 0.02~2.00 mg/L, respectively(r≥0.999), the limit of quantification was 0.020, 0.015, and 0.010 mg/L, the extraction recovery was over 79%, 74% and 58%, within-day and between-day precisions were less than 10%, 7.3% and 9.7%, respectively. ConclusionThe established method is accurate, sensitive and convenient for detecting blood concentration of loganin, ferulic acid and stilbene glucoside. It could provide a renference for studying pharmacokinetics of active ingredients in Bushen Tongluo Formula.

Key wordsBushen Tongluo Formula; loganin; ferulic acid; stilbene glucoside; blood concentration; HPLC

補(bǔ)腎通絡(luò)方是臨床常用有效治療腎病綜合征(Nephrotic syndrome, NS)的經(jīng)驗(yàn)方，由制首烏、白術(shù)、當(dāng)歸、丹參、淮山、山茱萸、川芎、爵床、車前子、澤蘭等藥物組成，臨床及實(shí)驗(yàn)研究表明其對(duì)NS腎虛夾瘀癥有較好的治療作用[1-3]．為進(jìn)一步闡明該方的作用機(jī)制，建立其主要活性成分的體內(nèi)分析方法尤為重要．馬錢苷是山茱萸的有效成分之一，具有增強(qiáng)機(jī)體免疫能力等生理活性[4-5]．阿魏酸是當(dāng)歸和川芎的有效成分之一，具有抗氧化、抗血栓、降血脂、抗菌消炎、解毒保肝等作用[6-8]．二苯乙烯苷是首烏的有效成分之一，具有抗氧化、調(diào)血脂的作用，可延緩或減輕動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生和發(fā)展[9-10]．本實(shí)驗(yàn)建立了灌胃補(bǔ)腎通絡(luò)方大鼠體內(nèi)血漿中馬錢苷、阿魏酸和二苯乙烯苷的含量測(cè)定方法，為補(bǔ)腎通絡(luò)方作用機(jī)制的進(jìn)一步研究奠定分析基礎(chǔ)．

1儀器、試劑與材料

Agilent 1100型高效液相色譜儀(美國(guó)Agilent公司)；MX-S型渦旋儀(北京大龍興創(chuàng)實(shí)驗(yàn)儀器有限公司)；TG-16G高速離心機(jī)(湖南凱達(dá)科學(xué)儀器有限公司)；MTN-2800D氮吹濃縮裝置(天津恬靜奧特賽恩斯儀器有限公司)；AUW220D分析天平(日本Shimadzu公司)；SZ-93自動(dòng)雙重純水蒸餾器(上海雅榮生化儀器設(shè)備有限公司)．

馬錢苷對(duì)照品(批號(hào)11640-201005，質(zhì)量分?jǐn)?shù)99.2%)、阿魏酸對(duì)照品(批號(hào)110773-201012，質(zhì)量分?jǐn)?shù)99.6%)、二苯乙烯苷(2,3,5,4′-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D葡萄苷)對(duì)照品(批號(hào)110844-201310，質(zhì)量分?jǐn)?shù)91%)均購自中國(guó)食品藥品檢定研究院，甲醇、乙酸乙酯為色譜純，水為重蒸水，其余試劑均為分析純．補(bǔ)腎通絡(luò)方稠浸膏由湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院制劑科制備(批號(hào)20130406)，含生藥10 g/mL．項(xiàng)目組前期研究測(cè)定補(bǔ)腎通絡(luò)方稠浸膏中馬錢苷、阿魏酸和二苯乙烯苷質(zhì)量濃度分別為2.5147，0.2925，3.1190 g/L[11]．

清潔級(jí)近交系雄性Sprague-Dawlay(SD)大鼠，購自湖南中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，體重250±20 g，SPF級(jí)動(dòng)物房標(biāo)準(zhǔn)飼料常規(guī)飼養(yǎng)，合格證號(hào)為SCXK(湘)2011-0003．

2方法與結(jié)果

2.1　對(duì)照品溶液的制備

準(zhǔn)確稱取馬錢苷、阿魏酸和二苯乙烯苷各10 mg，置10 mL容量瓶中，加甲醇溶解定容至刻度，搖勻，制成1.0 g/L的對(duì)照品儲(chǔ)備液；精密量取適量，用甲醇稀釋成系列混合對(duì)照品溶液，質(zhì)量濃度分別為0.05，0.75，1.00，1.50，2.50，5.00，25，50，100和150 mg/L，置于4 ℃冰箱內(nèi)備用．

2.2　血漿樣品的制備及預(yù)處理

取雄性SD大鼠6只(250～280 g)，隔夜禁食24 h，自由飲水．將補(bǔ)腎通絡(luò)方稠浸膏按15 μL/g大鼠灌胃給藥，分別于給藥前及給藥后30 min采血，置涂肝素鈉的PCR管中，8 000 r/min，4 ℃下離心10 min，取上清血漿，分裝標(biāo)號(hào)，于-20 ℃保存?zhèn)溆茫?/p>

用微量加樣器取150 μL血漿，置于0.5 mL棕色高速離心管中，加入450 μL甲醇-乙酸乙酯(V甲醇∶V乙酸乙酯=3∶1)混合溶液，渦旋1 min，10 000 r/min高速離心10 min，提取兩次合并上層有機(jī)相，然后加入1.0 mol/L的鹽酸25 μL，常溫下氮?dú)鈸]干，殘?jiān)鼫?zhǔn)確加入25 μL流動(dòng)相(V甲醇∶V0.01%乙酸水溶液=30∶70)復(fù)溶，渦旋1 min，10 000 r/min 離心5 min，取上清液10 μL進(jìn)樣．

2.3　色譜條件及方法專屬性考察

色譜條件：色譜柱：Johnson spherigel(大連江申)C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm); 流動(dòng)相：甲醇-0.01%乙酸水溶液梯度洗脫(0~18 min，30%甲醇；18~25 min，30%~45%甲醇；25~30 min，45%~50%甲醇；30~35 min，50%~30%甲醇); 流速：1.0 mL/min; 檢測(cè)波長(zhǎng)： 235 nm(0~18 min)，320 nm(18~32 min)，235 nm(32~35 min)；柱溫：30 ℃; 進(jìn)樣量：10 μL．

專屬性考察：精密取大鼠空白血漿、大鼠空白加標(biāo)血漿(相當(dāng)于馬錢苷、阿魏酸及二苯乙烯苷質(zhì)量濃度2.0 mg/L)和含藥血漿各150 μL，按2.2項(xiàng)下血漿樣品預(yù)處理操作，按2.3項(xiàng)下色譜條件測(cè)定．

2.4　標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制及最低檢測(cè)限和定量限

精密移取大鼠空白血漿147 μL，分別精密加入系列混合對(duì)照品溶液3 μL，渦旋混勻1 min，其余按2.2項(xiàng)下血漿樣品預(yù)處理操作，得到系列質(zhì)量濃度(0.01，0.02，0.03，0.10，0.50，2.0和3.0 mg/L)的空白加標(biāo)血漿溶液，每個(gè)質(zhì)量濃度平行制備3份．按2.3項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，分別以馬錢苷、阿魏酸、二苯乙烯苷峰面積(A)與對(duì)應(yīng)進(jìn)樣質(zhì)量濃度(c)進(jìn)行線性回歸，得馬錢苷的回歸方程為A=73.1c-0.06,r=0.999，馬錢苷血漿質(zhì)量濃度在0.03~3.00 mg/L線性關(guān)系良好；阿魏酸的回歸方程為A=215.2c-3.97,r=0.999，阿魏酸血漿質(zhì)量濃度在0.03~3.00 mg/L線性關(guān)系良好；二苯乙烯苷的回歸方程為A=34.5c+0.775,r=0.999，二苯乙烯苷血漿質(zhì)量濃度在0.02~2.00 mg/L線性關(guān)系良好．馬錢苷、阿魏酸和二苯乙烯苷的檢測(cè)限(S/N=3)分別為0.020，0.015，0.010 mg/L，定量限(S/N=10)分別為0.03,0.03,0.02 mg/L．

2.5　精密度試驗(yàn)

精密量取2.1項(xiàng)下的混合對(duì)照品溶液適量加入空白血漿，按2.2項(xiàng)下操作，制備低、中、高3種濃度的空白加標(biāo)血漿樣品，每個(gè)濃度進(jìn)樣5次，測(cè)定日內(nèi)精密度．重復(fù)操作，連續(xù)測(cè)定3 d，測(cè)定日間精密度．結(jié)果見表1．

2.6　重復(fù)性試驗(yàn)

取空白血漿，按2.2項(xiàng)下方法配制質(zhì)控樣品相當(dāng)于馬錢苷、阿魏酸和二苯乙烯苷質(zhì)量濃度為0.5，1.0，2.0 mg/L的血漿樣品各5份，依法測(cè)定．得高、中、低質(zhì)量濃度的RSD: 馬錢苷分別為7.5%，6.0%和4.1%，阿魏酸分別為6.8%，5.1%和4.0%，二苯乙烯苷分別為7.8%，5.3%和5.0%．

2.7　回收率試驗(yàn)

根據(jù)灌胃后30 min血樣中馬錢苷、阿魏酸、二苯乙烯苷血藥濃度，按2.4項(xiàng)下方法制得高、中、低濃度的血漿質(zhì)控樣品，每個(gè)濃度連續(xù)進(jìn)樣3次，依法測(cè)定，記錄峰面積，與未經(jīng)處理的相同濃度的對(duì)照品溶液的峰面積比較，計(jì)算加樣回收率．結(jié)果見表2．

表2　回收率試驗(yàn)結(jié)果

2.8　血藥濃度測(cè)定

取2.2項(xiàng)下制備的含藥血漿樣品，依法測(cè)定，用標(biāo)準(zhǔn)曲線法計(jì)算，得馬錢苷、阿魏酸、二苯乙烯苷的血藥濃度，結(jié)果見表3．

表3　樣品測(cè)定結(jié)果(n=6)

3討論

3.1　色譜條件的優(yōu)化

考察了多種不同的流動(dòng)相(甲醇-水，乙腈-水，甲醇-磷酸鹽水溶液，甲醇-乙酸水溶液)組成及流動(dòng)相比例，最終確定甲醇-0.01%乙酸水溶液(pH=4，阿魏酸的pKa值為4.3，在pH值小于4.3的流動(dòng)相中主要以阿魏酸分子的形式存在，能延長(zhǎng)其在反相色譜柱內(nèi)的保留時(shí)間，使之與血漿樣品中內(nèi)源性物質(zhì)達(dá)到分離)為流動(dòng)相．在本梯度洗脫條件下，大鼠血漿中馬錢苷、阿魏酸、二苯乙烯苷與血漿中蛋白雜峰、內(nèi)源性物質(zhì)、補(bǔ)腎通絡(luò)方復(fù)方的其他成分以及這些成分的體內(nèi)代謝物和結(jié)合性成分均能很好地分離，峰形良好，且出峰時(shí)間適宜(保證阿魏酸與二苯乙烯苷達(dá)到較好分離的前提下，最遲出峰的二苯乙烯苷保留時(shí)間約28 min)．本方法檢測(cè)限分別為馬錢苷0.020 mg/L、阿魏酸0.015 mg/L、二苯乙烯苷0.010 mg/L，日內(nèi)、日間精密度均小于或等于10%，重復(fù)性好，符合體內(nèi)藥物濃度測(cè)定的要求．

3.2　血漿樣品預(yù)處理方法的優(yōu)化

在預(yù)試驗(yàn)中對(duì)血漿樣品的處理方法進(jìn)行了優(yōu)化，比較了甲醇、乙腈、乙酸乙酯、乙醇對(duì)血漿樣品中馬錢苷、阿魏酸、二苯乙烯苷的提取效果，同時(shí)也考察了不同體積比提取溶劑對(duì)目標(biāo)成分的提取效果．最終采用甲醇-乙酸乙酯(V甲醇∶V乙酸乙酯=3∶1)混合溶劑提取，樣品與提取溶劑比為V血漿樣品∶V甲醇∶V乙酸乙酯=1∶3∶1，操作簡(jiǎn)便，滿足3種分析成分同時(shí)提取測(cè)定的要求．

血漿預(yù)處理過程如果不加1.0 mol/L鹽酸，則檢測(cè)不到阿魏酸的色譜峰，這可能是由于阿魏酸發(fā)生離子化，不易進(jìn)入有機(jī)相，加鹽酸酸化可以使阿魏酸游離．

由于阿魏酸及二苯乙烯苷見光不穩(wěn)定，故采用避光操作，所用樣品容器均為棕色．

考慮到藥動(dòng)學(xué)研究中動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的采血量有限、樣品量較小，本實(shí)驗(yàn)均為微量操作，馬錢苷、阿魏酸提取回收率大于74%，二苯乙烯苷由于具有酚醚結(jié)構(gòu)，在酸性條件下提取及測(cè)定有部分損失，提取回收率也超過58%，滿足血藥濃度的測(cè)定要求．

本實(shí)驗(yàn)建立了灌胃補(bǔ)腎通絡(luò)方大鼠血漿中馬錢苷、阿魏酸和二苯乙烯苷含量的同時(shí)測(cè)定方法，為進(jìn)一步開展其主要有效成分在動(dòng)物體內(nèi)的藥動(dòng)學(xué)研究提供參考．

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(編輯楊春明)

*通訊作者,E-mail：lyh@hunnu.edu.cn

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(21275052，21175042)；湖南省高校科技創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)支持計(jì)劃資助項(xiàng)目；湖南省教育廳/財(cái)政廳重點(diǎn)資助項(xiàng)目(12A098)；湖南省大學(xué)生創(chuàng)新性實(shí)驗(yàn)計(jì)劃項(xiàng)目(2013-176)

收稿日期：2014-12-27

中圖分類號(hào)R284.1

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼A

文章編號(hào)1000-2537(2015)03-0053-05

DOI:10.7612/j.issn.1000-2537.2015.03.010