生命早期不同營養狀態對大鼠體質量及下丘腦mTOR表達的影響

作者單位：510630 廣州，中山大學附屬第三醫院兒科(余婧，朱順葉，唐本玉，潘思年，張敏，彭碧秀)；510080 廣州，中山大學中山醫學院在讀碩士研究生(余婧)

生命早期不同營養狀態對大鼠體質量及下丘腦mTOR表達的影響

余婧朱順葉唐本玉潘思年張敏彭碧秀

【摘要】目的研究生命早期的營養狀態對各生長期大鼠體質量、下丘腦哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)表達的影響。方法將84只1日齡SD大鼠分為小窩組(40只)與對照組(44只，哺乳期死亡2只)，母乳喂養至21日齡。斷乳后將2組大鼠各自隨機分為高脂組及普通組，于不同生長期取鼠測量體質量、Lee’s指數、內臟脂肪質量(VFM)及檢測下丘腦mTOR的表達情況。結果未發育期小窩組體質量明顯高于對照組(P<0.05)。自發育前期起，高脂喂養雌性大鼠Lee’s指數及VFM均高于普通喂養大鼠，高脂喂養的小窩大鼠的體質量明顯高于普通喂養的對照大鼠(P均<0.05)。高脂喂養雄性大鼠體質量、Lee’s指數及VFM均高于普通喂養大鼠(P<0.05)。小窩組下丘腦mTOR的相對表達量高于對照組(P=0.015)，高脂喂養大鼠下丘腦mTOR相對表達量高于普通喂養大鼠(P<0.05)。結論生命早期不同營養狀態對大鼠不同生長時期的體質量有影響，并持續影響其下丘腦mTOR的表達，最終可能導致能量代謝紊亂。

【關鍵詞】生命早期；營養；體質量；哺乳動物雷帕霉素靶蛋白；大鼠

DOI:10.3969/g.issn.0253-9802.2015.06.005

基金項目：廣東省自然科學基金(94510089010021202)

通訊作者，朱順葉

收稿日期：(2015-01-02)

Effect of different nutritional status during early life on the weight and hypothalamic mTOR expression in ratsYuJing,ZhuShunye,TangBenyu,PanSinian,ZhangMin,PengBixiu.DepartmentofPediatric,theThirdAffiliatedHospitalofSunYat-senUniversity,Guangzhou510630,China

Correspondingauthor,ZhuShunye

Abstract【】ObjectiveTo evaluate the effect of different nutritional status during early life upon the weight and the expression of hypothalamic mammalian target of rapamycin(mTOR) in rats of varying developmental stages. MethodsEighty-four Sprague-Dawley rats aged 1 day were assigned into the small (n=40) and control groups (n=44, 2 rats died during lactation period), and breast-fed until 21 days of age. Then, the rats were randomly divided into the high-fat feeding and normal feeding groups. The rats’ weight, Lee’s index, visceral fat mass (VFM) and the expression of hypothalamic mTOR were measured at different developmental stages. ResultsThe weight of prepubertal rats in the small group was significantly higher than that in the control group (P<0.05). Since early pubertal stage, the Lee’s index and VFM of female rats in the high-fat feeding group were considerably higher than those in the normal feeding group (both P<0.05). The weight of rats fed with high-fat diet in the small group was significantly higher compared with that of control rats with normal feeding (P<0.05). The weight, Lee’s index and VFM of male rats with high-fat feeding were significantly higher compared with those of the control rats (all P<0.05). The relative expression of hypothalamic mTOR of the rats in the small group was dramatically higher than that of the animals in the control group (P=0.015). The relative expression of hypothalamic mTOR in the rats with high-fat feeding was significantly higher than that in rats with normal feeding (P<0.05). ConclusionsThe nutritional status during early life exerts an effect upon the rat weight during different developmental stages and persistently affects the expression of hypothalamic mTOR, probably eventually leading to energy metabolism disorders.

【Key words】Early life; Nutrition; Weight; Mammalian target of rapamycin; Rat

兒童單純性肥胖癥的發生不僅與喂養方式、膳食結構相關，有研究證實哺乳期營養過剩對成年肥胖的發生有重要影響[1]。下丘腦哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)信號通路在感知能量變化反饋以調節食物攝取達到能量均衡的過程中起著重要作用，該信號通路的異常表達會導致能量代謝的異常，與單純性肥胖的產生密切相關[2]。有研究顯示哺乳期營養過剩對兒童及成年肥胖的發生有重要影響[3]。根據Lucas的“營養程序化”研究，生命早期不良營養環境會增加個體罹患代謝性疾病的風險[4]。近期的權威研究顯示，與正常大鼠比較，小窩模型大鼠下丘腦DNA有細微的甲基化改變，這種細微的甲基化改變是否會導致下丘腦mTOR的表達改變最終導致肥胖的發生，筆者見目前似尚無研究證實[5]。本研究將模擬生命早期營養差異，在不同發育時期觀察大鼠體質量及下丘腦mTOR表達的改變，為兒童肥胖的防治提供新的思路。

材料與方法

一、動物模型

本實驗采用孫志等[6]改進后的高脂飼料，由廣東省醫學動物實驗中心配制。實驗動物為SPF級同系1日齡SD大鼠84只(體質量6～8 g，雌雄各半)，由中山大學實驗動物中心提供，許可證號為SCXK(粵)2011-0029。所有操作和實驗流程均遵守《實驗動物管理條例》，動物在實驗過程中自由進食和進水，定時測定體質量。整個實驗設計經中山大學動物實驗倫理委員會批準，符合動物實驗倫理。

1.小窩模型的建立

根據文獻，哺乳期營養過剩狀態可通過小窩模型進行模擬[6]。將84只1日齡SD大鼠分為小窩組(S組，40只)與對照組(C組，44只)。S組4只乳鼠1籠，由1只母鼠喂養，共10籠；對照組(C組)11只乳鼠1籠，由1只母鼠喂養，共4籠。2組均由母鼠喂養至生后21 d，其中對照組乳鼠死亡2只。

2.哺乳后營養干預

斷乳后分別將S組與C組如下隨機分組進行不同的營養干預：高脂小窩組(SF組，20只)、普通小窩組(SN組，20只)、高脂對照組(CF組，21只)以及普通對照組(CN組，21只)，分別飼以高脂及普通飼料。4組大鼠在造模期間均自由攝食和飲水，室內晝夜溫度(22±2)℃，晝夜時間均為12 h，濕度控制于55%～65%。

二、動物處理

于大鼠腹主動脈取血，采用頸椎脫臼法將其處死。取腸系膜、生殖器及腎臟等周圍脂肪稱質量，即為內臟脂肪質量(VFM)[9]。迅速分離大鼠下丘腦置于液氮中保存，下丘腦定位為，頭側至視交叉前3 mm，尾側至乳頭體，兩側至下丘腦溝，深度為3 mm。

三、下丘腦總mTOR測定

取適量大鼠下丘腦組織，加入相應組織細胞裂解液于玻璃勻漿器內勻漿，勻漿離心后取上清液1 μl用BCA法測定蛋白濃度。使用常規蛋白免疫印跡法制備蛋白樣品，并進行垂直電泳、濕法轉膜孵育一抗、二抗，用成像系統成像并進行灰度分析。半定量分析各樣本下丘腦mTOR和內參β-actin的含量，計算各個實驗組mTOR的相對表達量。

四、統計學處理

結果

一、哺乳期喂養方式對未發育期大鼠體質量的影響

大鼠初始體質量、喂養方式對未發育期大鼠體質量、Lee’s指數及VFM的影響見表1。2窩大鼠的初始體質量比較差異無統計學意義(P>0.05)。給予不同的哺乳方式后，S組體質量增長較快，斷乳時S組與C組體質量及Lee’s指數比較差異均有統計學意義(P均<0.05)，而VFM比較差異無統計學意義(P>0.05)。

表1　不同喂養方式對S組及C組未發育期

二、不同飼料對發育前期、發育期及成年期雌性大鼠體質量、Lee’s指數及VFM的影響

不同飼料喂養對發育前期、發育期及成年期雌性大鼠的體質量、Lee’s指數及VFM的影響見表2。在發育前期，高脂飼料僅對雌性大鼠的Lee’s指數及VFM有明顯影響，CN組與CF組、SN組與SF組Lee’s指數及VFM比較差異有統計學意義(P均<0.05)。從發育期起，高脂飼料明顯影響S組雌性大鼠體質量， SN組與SF組雌性大鼠體質量比較差異有統計學意義(P<0.05)，同時高脂飼料明顯影響雌性大鼠的Lee’s指數及VFM，CN組與CF組、SN組與SF組雌性大鼠的Lee’s指數及VFM比較差異均有統計學意義(P均<0.05)。

三、不同飼料對發育前期、發育期及成年期雄性大鼠體質量、Lee’s指數及VFM的影響

不同飼料喂養對發育前期、發育期及成年期雄性大鼠體質量、Lee’s指數及VFM的影響見表3。發育前期及發育期，高脂飼料對雄性大鼠體質量、Lee’s指數及VFM均有顯著影響，CN組與CF組、SN組與SF組雄性大鼠體質量、Lee’s指數及VFM比較差異有統計學意義(P均<0.05)。在成年期，高脂喂養的雄性大鼠和體質量、Lee’s指數及VFM均高于普通喂養的雄性大鼠，CN組與CF組、CF組與SF組、SN組與SF組體質量、Lee’s指數及VFM比較差異有統計學意義(P均<0.05)。

表2　不同飼料對發育前期、發育期及成年期雌性大鼠體質量、Lee’s指數及VFM的影響 ± s)

注：與CF組比較，aP<0.05；與SN組比較，bP<0.05；與SF組比較，cP<0.05

四、不同營養狀態對大鼠下丘腦mTOR表達的影響

不同營養狀態對各生長期大鼠下丘腦mTOR的相對表達量見圖1及表4。未發育期S組下丘腦mTOR的相對表達量明顯高于C組(P=0.015)。發育前期至成年期，SF組下丘腦mTOR相對表達量均明顯高于CF組與SN組(P均<0.05)。發育期前，SN組大鼠mTOR相對表達量明顯高于CF組(P均<0.05)，成年期CF組mTOR相對表達量升高并明顯高于SN組(P=0.012)。發育前期至成年期，CN組mTOR相對表達量均明顯低于CF組(P均<0.05)。

表3　不同飼料對發育前期、發育期及成年期雄性大鼠體質量、Lee’s指數及VFM的影響 ± s)

注：與CF組比較，aP<0.05；與SN組比較，bP<0.05；與SF組比較，cP<0.05

表4　各組大鼠在各生長發育期下丘腦mTOR的相對表達量 ± s)

注：與CF組比較，aP<0.05；與SN組比較，bP<0.05；與SF組比較，cP<0.05

圖1各組大鼠未發育期、發育前期、發育期、成年期下丘腦mTOR的表達比較

A: 未發育期；B: 發育前期； C: 發育期； D: 成年期

討論

近年的研究顯示，生命早期(胎兒期和斷乳前后)是生長發育的關鍵時期，即產生程序性影響的敏感時期，該時期的營養狀態將會對個體的生長發育及成年疾病的發生產生長遠影響[10]。目前，大鼠單純性肥胖模型的建立多是通過單純給予高脂飼料喂養8～16周而建立的[11]。這類方式建立的肥胖大鼠在造模結束后已處于成年期，并不適合進行兒童肥胖的研究。本研究通過調整每窩中新生仔鼠的數目，形成小窩喂養和對照喂養，并在斷乳后分別予以不同的飼料喂養，不僅模擬了生命早期不同營養狀態，還模擬了肥胖兒童的生活方式。本研究中，小窩大鼠體質量在未發育期已明顯高于對照小鼠，與鄭緒陽2007年的研究結果一致。在斷乳后至成年期，無論予高脂或普通飼料喂養，小窩大鼠體質量增長均較對照大鼠快，提示生命早期采用不同喂養方式(小窩或對照)不僅會影響哺乳期大鼠體質量改變，還會影響成年期大鼠的體質量。這種體質量增長的差異可由Lucas提出的“營養程序化”假說來解釋[4]。眾多動物研究也顯示哺乳期營養過剩會導致幼崽體質量增加、發生高胰島素血癥及高瘦素血癥[12]。本研究結果顯示，SF組較CF組體質量增長快，提示哺乳期營養過剩狀態會增加大鼠對高脂飲食的敏感性，從而更易引發食源性肥胖，這與Plagemann等[13]的研究結果一致。

mTOR是一種絲/蘇氨酸蛋白激酶，分子量為289 kDa，由2 459個氨基酸分子組成。mTOR是PI3K/PKB信號通路下游的一個效應蛋白，能夠識別有絲分裂原、能量和營養水平，調節細胞的生長和自噬[16]。近年有學者發現下丘腦mTOR在機體能量感受方面起著重要作用，此外其還發現mTOR信號在營養不良的狀態下將被抑制[17]。本研究中，未發育期、發育前期、發育期小窩大鼠下丘腦mTOR的表達水平明顯高于對照大鼠，提示早期營養過剩將增加大鼠下丘腦mTOR的表達量。有研究顯示，持續激活mTOR可抑制機體能量攝入和增加脂肪動員，而這種抑制食物攝入作用是與APMK信號通路協同完成的[18-19]。我們發現與對照大鼠比較，小窩大鼠的下丘腦mTOR表達增多，但體質量也增加較明顯，另外，高脂飼養的大鼠下丘腦mTOR表達量也較普通飼養的大鼠高，并出現體質量持續增長的現象，推測可能與mTOR信號通路的異常有關。mTOR信號通路不能被正常激活，攝食行為不能被及時抑制，繼而出現體質量持續增長。近期的權威研究顯示，與正常大鼠比較，小窩模型大鼠下丘腦DNA有細微的甲基化改變，這是否與mTOR信號通路異常表達有關，尚待進一步研究[5]。

綜上所述，本研究發現生命早期不同營養狀態對大鼠不同生長時期的體質量以及下丘腦mTOR的表達有影響，提示哺乳期的營養狀態過剩可能導致兒童期及成年期體質量增長過快，同時會增加個體對于高脂飲食的敏感性，從而更易引發肥胖。同時，哺乳期營養過剩可能會導致下丘腦mTOR信號通路的異常激活，從而使mTOR信號通路的能量平衡作用無法實現，最終可能導致單純性肥胖的發生，甚至出現青春期發育異常、代謝綜合征等問題，這為防治兒童單純性肥胖提供了新的思路。

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(本文編輯：洪悅民)

基礎研究論著