薄膜-超聲法制備蘆丁固體脂質納米粒的研究

·藥劑·

薄膜-超聲法制備蘆丁固體脂質納米粒的研究

羅小燕，呂竹芬*，陳燕忠，王國強，林嘉成，鄧廣漢

(廣東藥學院藥物研究所/廣東省藥物新劑型重點實驗室，廣州510006)

摘要：目的優化薄膜-超聲法制備蘆丁固體脂質納米粒的處方。方法 以包封率為指標，采用正交設計優化法考察硬脂酸和大豆卵磷脂的用量、吐溫-80和聚乙二醇-400的體積分數對包封率的影響，優選最佳處方。用透射電鏡觀察外觀形態，用電位/納米粒度分析儀分析納米粒的粒徑及Zeta電位，用透析法評價體外釋藥特征。結果 以最佳處方制備的蘆丁固體脂質納米粒呈類球形，平均粒徑為 195.8±11 nm，Zeta電位為-20.65±0.6 mV，平均包封率為86.31%，72 h體外累積釋放87.32%。結論 按最佳處方工藝制備的蘆丁固體脂質納米粒具有較高的包封率和較好的緩釋效果。

關鍵詞：蘆丁；固體脂質納米粒；體外釋藥；薄膜-超聲法

doi:10.3969/j.issn.1004-2407.2015.03.015

中圖分類號：R944

文獻標志碼：A

文章編號：1004-2407(2015)03-0267-04

Abstract:ObjectiveTo optimize the technique for preparing Rutin Solid Lipid Nanoparticles (RT-SLN) by film-ultrasonic dispersion.MethodsThe formulation was optimized by an orthogonal design.The entrapment efficiency was used as an index to investigate the factors of stearic acid， leci-thin，Tween-80 concentration and PEG-400 concentration.The electron microscope was used to observe the surface of RT-SLN by negative-dying.Particle size and Zeta potential were determined by laser particle analyzer，and drug release in vitro was evaluated by dialysis.ResultsRT-SLN were spherical. Its partical size was 195.8±11 nm，Zeta potential was -20.65±0.6 mV， and the entrapment efficiency was 86.31%.The cumulative release rate was 87.32% within 72 hours in vitro.ConclusionRutin Solid Lipid Nanoparticals could be prepared under the optimized conditions with high entrapment efficiency and in vitro sustained release characteristics.

基金項目：廣東省教育廳科技計劃項目(編號：GCZX-A0807)

作者簡介：羅小燕，女，碩士研究生

收稿日期：(2015-03-02)

Preparation of Rutin Solid Lipid Nanoparticles by film-ultrasonic method

LUO Xiaoyan，Lü Zhufen*，CHEN Yanzhong，WANG Guoqiang，LIN Jiacheng，DENG Guanghan(Institute of Material Medica/Key Laboratory of Advanced Drug Delivery of Guangdong Province，Guangdong Pharmaceutical University，Guangzhou 510006，China )

Key words: rutin；solid lipid nanoparticles；invitrorelease；film-ultrasonic method

*通信作者：呂竹芬，女，教授

蘆丁(rutin)又稱蕓香苷，是槲皮素與蕓香糖形成的苷，難溶于水，溶于甲醇，既可作為治療藥物，又可作為保健品[1-2]。其具有抗炎、抗病毒、抗輻射、抑制醛糖還原酶、抗過敏、利尿、解痙、鎮咳等多種藥理活性，臨床用于防治腦溢血、視網膜出血、高血壓、紫癜和急性出血性腎炎等疾病，但是蘆丁脂溶性和水溶性都很差，口服幾乎不被人體吸收[2-3]，生物利用度低。固體脂質納米粒是以生理相容的高熔點脂質為骨架材料制成的新型藥物傳遞載體，具有廣泛的藥物適應性、良好的生物相容性，可以提高難溶性藥物的溶解度，減少藥物毒性，延緩藥物釋放，促進藥物吸收[4-8]。

本研究采用薄膜-超聲法制備蘆丁固體脂質納米粒，以包封率為評價指標，采用正交設計法對處方進行優化，并對最優處方制備的納米粒的形態、粒徑、Zeta電位、體外釋藥行為進行評價，為蘆丁新型給藥系統的開發與應用奠定實驗基礎。

1儀器與試藥

1.1儀器Agilent 1260型高效液相色譜儀(美國Agilent公司，DAD檢測器)；Delsa Nano C電位/納米粒度分析儀(美國Beckman Coulter公司)；JY88-IIN型超聲波細胞破碎儀(寧波新芝生物科技股份有限公司)；JEM-100CXII透射電鏡(日本電子株式會社)；CP 225 D型電子分析天平(德國賽多利斯公司)；TGL-20000-CR型高速臺式冷凍離心機(上海安亭科學儀器廠)；超濾離心管(截留相對分子質量10 kD，美國Millipore公司)。

1.2試藥 蘆丁原料藥(質量分數99.0%，LOT: R106911，湖北興銀河化工有限公司)；蘆丁對照品(質量分數99.0%，LOT: 100802-201406，中國藥品生物制品檢定所)；大豆卵磷脂(德國Lipoid公司)；硬脂酸(廣東達濠化工廠)；聚山梨酯-80(天津市大茂化學試劑廠)；聚乙二醇-400(廣東汕頭市西隴化工廠)。

2方法與結果

2.1蘆丁固體脂質納米粒的制備精密稱取一定量的蘆丁、硬脂酸和大豆卵磷脂，置于圓底燒瓶中，加入適量甲醇超聲使其溶解，于70 ℃旋轉蒸發，使其形成均勻薄膜層。加入同溫度下一定體積分數的聚乙二醇-400溶液5 mL和聚山梨酯-80 5 mL，超聲20 min使薄膜層與水相充分混合。冰水浴下以細胞破碎儀超聲分散(功率400 W，3 s)60次，經0.45 μm微孔濾膜過濾，即得蘆丁固體脂質納米粒混懸液，4 ℃保存備用。

2.2 蘆丁固體脂質納米粒含量測定

2.2.1色譜條件 色譜柱：Kromasil 100-5 C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)；以甲醇-冰醋酸溶液(35∶65)為流動相；檢測波長：257 nm；柱溫：30℃；流速：1 mL·min-1；進樣量：10 μL。

2.2.2 線性考察 精密稱取12.11 mg蘆丁對照品，置于100 mL量瓶中，甲醇稀釋至刻度，渦旋混勻，得質量濃度為121.1 μg·mL-1的儲備液。精密量取儲備液適量，分別用甲醇稀釋成質量濃度為6.055，12.11，24.22，48.44，72.66，96.88和108.99 μg·mL-1的系列對照品溶液，按2.2.1項下色譜條件進樣測定，以峰面積(A)與質量濃度(C)進行線性回歸。得回歸方程：A=49.628C+1.467 8(r=0.999 5)。結果表明，藥物質量濃度在6.055~108.99 μg·mL-1范圍內呈良好的線性關系。

2.2.3 專屬性實驗 分別以對照品、樣品和空白固體脂質納米粒混懸液進樣測定，記錄色譜圖，處方中輔料對樣品測定無干擾。

2.2.4 重復性實驗 精密量取1 mL蘆丁固體脂質納米粒混懸液，按2.2.8項下方法平行配制6份供試品溶液，依法測定，計算含量。測得平均含量為99.86 μg·mL-1，RSD為0.43 %。表明該方法重復性良好。

2.2.5 精密度實驗 取2.2.4項下同一供試品溶液，連續重復進樣6次，記錄峰面積，測得RSD為0.34%，表明該方法精密度良好。

2.2.6 穩定性實驗 取2.2.4項下制備的同一供試品溶液，分別于0，2，4，6，8，12，24，36，48，60和72 h進樣測定，測得峰面積RSD為 1.39%，表明供試品溶液在72 h內穩定。

2.2.7 回收率實驗 精密量取3份2.2.4項下同一批蘆丁固體脂質納米粒混懸液0.5 mL，置于10 mL量瓶中，分別加入121.1 μg·mL-1的對照品溶液0.3，0.4和0.5 mL，按2.2.8項下方法平行配制供試品各3份，濾過，取續濾液按2.2.1項下色譜條件進樣測定，計算平均回收率為98.28% ，RSD為1.23%。

2.2.8 含量測定 分別精密量取3批蘆丁固體脂質納米粒混懸液各1 mL，加甲醇溶解并超聲5 min(100 W)，定容至10 mL，濾過，取續濾液按2.2.1項下色譜條件進樣測定。另取蘆丁對照溶液，同法進樣測定。按外標法計算，得3批供試品的含量分別為 99.86，103.11和101.21 μg·mL-1。

2.3蘆丁固體脂質納米粒包封率測定采用超濾離心法[9]測定蘆丁固體脂質納米粒混懸液的包封率，精密量取蘆丁固體脂質納米粒混懸液1 mL，置于Millipore超濾離心管中，以5 000 r·min-1離心15 min，以甲醇溶解沉淀并超聲破壞，定容至10 mL，按2.2.1項下色譜條件進樣測定包裹在脂質納米粒中的蘆丁含量M1；另取蘆丁固體脂質納米粒混懸液1 mL，加入甲醇超聲破壞并定容至10 mL，濾過，取續濾液按2.2.1項下色譜條件進樣測定脂質納米粒中總含藥量M總。

包封率(%)=M1/M總×100%

2.4 處方篩選 單因素考察發現，硬脂酸用量、聚山梨酯-80質量濃度、聚乙二醇-400體積分數、大豆卵磷脂用量對蘆丁固體脂質納米粒的成型、粒徑、電位、包封率和釋放均有較大影響，因此，以硬脂酸用量(A)、聚山梨酯-80質量濃度(B)、聚乙二醇-400體積分數(C)、大豆卵磷脂用量(D)作為處方優化考察因素，每個因素選擇3個水平，以包封率為指標，采用正交實驗設計優化處方，以正交表L9(34)設計實驗，因素水平見表1，實驗方法及結果見表2，方差分析見表3。

表1 因素水平表

Tab.1 The factors and levels

水平因 素A,硬脂酸用量/mgB,聚山梨酯-80質量濃度/mg·mL-1C,聚乙二醇-400體積分數/%D,大豆卵磷脂用量/mg15085502100101010031501515150

表2 處方優化正交實驗結果

Tab.2The results of the orthogonal design

實驗號因素ABCD包封率/%150855048.01250101010063.21350151515069.26410081015076.39510010155069.48610015510085.34715081510080.16815010515076.22915015105070.96K1180.48204.56209.57188.45K2231.21208.91210.56228.71K3227.34225.56218.90221.87R50.7321.009.3340.26

表3方差分析結果

Tab.3 The results of variance analysis

因素偏差平方和自由度均方平方和F比F臨界值顯著性優選方案A531.602265.8030.36*A2B81.90240.954.68F0.05(2,2)=19.0B3C17.5128.751.00F0.10(2,2)=9.0C3D309.392154.7017.67D2

由正交實驗及方差分析結果可知：選擇偏差平方和最小的因素C作為誤差項，對蘆丁固體脂質納米粒包封率影響大小順序為：A>D>B>C，因素A對蘆丁固體脂質納米粒包封率的影響有顯著性意義(P>0.05)。單因素考察中發現，聚乙二醇-400的體積分數越小，蘆丁緩釋效果越好，因此，采用聚乙二醇-400體積分數為5%，結合正交實驗結果分析，優化搭配為A2B3C1D2，此優化搭配與實驗方案中包封率最高的第6號實驗的水平組合一致。

2.5 優化處方的驗證實驗 由正交實驗優選的蘆丁固體脂質納米粒最佳處方，即蘆丁10 mg、硬脂酸100 mg、聚山梨酯質量濃度15 mg·mL-1、聚乙二醇-400體積分數5%、大豆卵磷脂100 mg，按2.1項下方法平行制備3批蘆丁固體脂質納米粒混懸液，以粒徑、包封率對最佳處方進行驗證，驗證結果見表4。

表4 驗證實驗結果

Tab.4 The results ofvalidation test

批號123平均值RSD%粒徑/nm198.30196.70191.80195.601.74包封率/%83.2187.3986.3385.642.54

由驗證實驗結果證明，通過正交設計得到的最佳條件其驗證值和計算值無顯著性差異，表明此處方工藝穩定。

2.6蘆丁固體脂質納米粒性質考察

2.6.1 外觀形態 采用透射電鏡觀察蘆丁固體脂質納米粒的形態。方法為取適量樣品溶液滴加到專用銅篩網上，用20 g·L-1磷鎢酸染色，用濾紙吸去多余的液體，自然干燥后置于透射電鏡下，觀察并拍攝照片。發現蘆丁固體脂質納米粒呈均一球形，粒子分布均勻，結果見圖1。

圖1蘆丁固體脂質納米粒透射電鏡圖

Fig.1 The TEM of RT-SLNs

2.6.2粒徑及Zeta電位 取一定量蘆丁固體脂質納米粒混懸液，用蒸餾水適當稀釋，采用電位/納米粒度分析儀測定粒徑分布及電位，結果蘆丁固體脂質納米粒的平均粒徑為195.8±11 nm，多分散性系數PI為0.12±0.03， Zeta電位為-20.65±0.6 mV。結果見圖2和圖3。

圖2粒徑分布圖

Fig.2 The particls size distribution

圖3Zeta電位分布圖

Fig.3 The Zeta potential of RT-SLNs

由圖4可知，蘆丁固體脂質納米粒混懸液可以延長藥物的釋放，具有一定的緩釋效果，72 h釋放總藥量為87.32%。作為對比的蘆丁混懸液在24 h內已經釋放總藥量的85%，48 h內幾乎釋放完全。

圖4 RT-SLN釋藥曲線

Fig.4 The release profile of RT-SLNs

3 討論

固體脂質納米粒的制備方法很多，主要有高壓乳勻法、溶劑擴散法、微乳液法、薄膜超聲分散法和高溫乳化-低溫固化法等[10-11]。本研究結合實驗室條件采用薄膜-超聲法制備蘆丁固體脂質納米粒，并對按最優處方制備的納米粒的外觀形態、粒徑、電位、包封率、體外釋藥特性進行評價，表明薄膜-超聲法適合制備蘆丁固體脂質納米粒。

由于蘆丁脂溶性和水溶性都較差，正交設計優化處方中考察了不同質量濃度的聚山梨酯-80和聚乙二醇-400作為乳化劑增加蘆丁的溶解度，形成脂質納米粒的過程中聚山梨酯-80、聚乙二醇-400和大豆卵磷脂形成一層包裹硬脂酸的膜，蘆丁可以濃集在這層乳化膜內，有效提高蘆丁固體脂質納米粒的包封率。正交設計優化處方所制備的蘆丁固體脂質納米粒，平均包封率為86.31%，平均粒徑為195.8±11 nm。脂質納米粒具有巨大的比表面積，可顯著改善蘆丁在消化液中的溶解度；具有較小的粒徑、良好的生物相容性，脂溶性高，能較好地黏附于胃腸道壁，延長藥物在胃腸道停留時間，增加蘆丁的吸收。

蘆丁固體脂質納米粒混懸液釋藥過程包括快釋和慢釋兩部分，前12 h屬于快釋過程，釋放了全部藥量約40.41%，這是由于蘆丁固體脂質納米粒中游離的蘆丁和吸附在納米粒表面的蘆丁，在漏槽的條件下導致藥物發生快釋過程。隨著納米粒兩側質量濃度差的增大，骨架型的固體脂質納米粒緩慢釋放，72 h時，其累積釋放率達到87.32%。

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