UPLC-Q-TOF/MS法鑒定獸藥磺胺二甲嘧啶在小鼠血液和尿液中的代謝產物

孫漢文，孟哲, 2,石志紅,呂運開

(1.河北大學化學與環境科學學院,河北省分析科學技術重點實驗室,河北保定　071002；

2.寧夏大學能源化工重點實驗室,寧夏銀川　753200)

UPLC-Q-TOF/MS法鑒定獸藥磺胺二甲嘧啶在小鼠血液和尿液中的代謝產物

孫漢文1，孟哲1, 2,石志紅1,呂運開1

(1.河北大學化學與環境科學學院,河北省分析科學技術重點實驗室,河北保定071002；

2.寧夏大學能源化工重點實驗室,寧夏銀川753200)

摘要：采用UPLC-Q-TOF/MS聯用技術鑒定了獸藥磺胺二甲嘧啶在小鼠血漿和尿液樣品中的代謝產物.并運用Q-TOF質譜儀進行MS和MS/MS精確質量數的測定，得到磺胺二甲嘧啶和各個代謝產物的準確分子質量和化學組成.依據精確質量數據，結合Metabolynx XS輔助軟件鑒定獸藥磺胺二甲嘧啶在ESI源正離子模式下的代謝產物.研究結果表明，磺胺二甲嘧啶在小鼠的血樣和尿樣中主要的目標代謝途徑為乙酰化反應，非目標代謝途徑主要為甲基化和結合反應.

關鍵詞：獸藥；磺胺二甲嘧啶；UPLC-Q-TOF/MS；代謝產物

DOI：10.3969/j.issn.1000-1565.2015.02.005

中圖分類號：O65

文獻標志碼：志碼：A

文章編號：編號：1000-1565(2015)02-0131-07

收稿日期:2014-10-15

基金項目：河北省應用基礎研究計劃重點基礎研究項目(10967126D)

Abstract:In the present study, the metabolic profile of sulfamethazine in vivo, a veterinary drug, was investigated using ultra-performance liquid chromatography coupled to high resolution quadrupole time-of-flight mass spectrometry to acquire structural information on sulfamethazine metabolites. The corresponding product ion spectra were acquired and interpreted, and structures were proposed. Accurate mass measurement using ESI-Q-TOF/MS was using to determine the elemental composition of metabolites, thereby confirming the proposed structures of these metabolites. This study demonstrated that acetylating metabolic reaction was predominantly observed in mice plasma and urine, including target metabolite N4-Acetylsulfamethazine, subcardinal metabolites come from methylating renction and conjugates reaction.

Identification of metabolites of veterinary drug sulfamethazine in mice

plasma and urine using ultra performance liquid chromatography

coupled to high resolution quadrupole time-of-flight mass spectrometry

SUN Hanwen1, MENG Zhe1,2, SHI Zhihong1, Lü Yunkai1

(1. Key Laboratory of Analytical Science and Technology of Hebei Province,

College of Chemistry and Environmental Science, Hebei University, Baoding 071002, China;

2.Key Laboratory of Energy Chemical Engineering, Ningxia University, Yinchuan 753200, China)

第一作者：孫漢文(1945- )，男，河北魏縣人，河北大學教授，博士生導師，主要從事光學分析、分離科學技術、環境分析化學和農獸藥殘留分析研究.E-mail： hanwen@hbu.edu.cn

Key words: veterinary drug; sulfamethazine; UPLC-Q-TOF/MS; metabolite

磺胺類藥物是一類人工合成抗菌藥，廣泛應用于預防和治療細菌感染性疾病，其中磺胺二甲嘧啶與其他磺胺類藥物一樣，可用作飼料添加劑，以提高奶牛、生豬的抗病能力，提高飼料的轉化率和促進動物的生長發育[1].獸藥殘留是動物用藥普遍存在的問題，而磺胺二甲嘧啶又是所有磺胺中殘留超標的主要藥物.許多國家和國際組織制定了磺胺類藥物總和的最大允許殘留限<0.1 mg/kg[2-3].中國和日本等國家規定牛奶中磺胺二甲嘧啶不得超過0.025 mg/kg和0.01 mg/kg[3].獸藥的使用無疑會導致原形藥物、代謝產物或雜質在動物細胞、組織和器官內以及可食性動物產品中滯留和蓄積[4].磺胺類藥物的主要代謝物為乙酰化磺胺，在尿中溶解度低，易在腎小管中結晶，導致對腎臟的損害[5].

體內各組織器官中藥物代謝產物的分析研究，往往會受到生物樣品中內源性物質如脂質、類固醇、膽紅素、糖類和蛋白質等成分的干擾，往往要求在復雜生物樣品基質中進行痕量藥物分析.傳統代謝物表征實驗使用液相色譜-放射性流動檢驗[6]和最新開發的放射性色譜與質譜法結合用于表征代謝物的技術[7]，均受獲得放射性標記物的制約.隨著現代質譜技術的快速發展，高效液相色譜-質譜聯用技術(HPLC-MS)已經成為檢測和鑒定代謝物首選的分析工具.采用三重四極桿串聯質譜進行產物離子掃描、中性丟失掃描和前體離子掃描是進行目標代謝產物篩查的常用手段，而采用離子阱質譜進行多級質譜分析(MSn)更是確認目標代謝物結構解析的有力工具[8-9].然而，新型質譜技術的出現，飛行時間(time-of-flight，TOF)質譜和傅里葉變換離子回旋共振質譜(FTICR-MS)等，可以獲得準分子離子和碎片離子的精確分子質量和分子組成，更有助于鑒定生物基質中可預測代謝途徑或不可預測代謝途徑產生的代謝物，并且大大縮短了鑒定藥物代謝物的研究時間.

目前，在缺少對照品情況下，超高效液相色譜-四極桿-飛行時間質譜(UPLC-Q-TOF-MS)聯用技術結合代謝物尋找軟件MetaboLynxTM已經用于藥物代謝產物的鑒定[10-12].通過對含藥樣品與空白樣品的比對分析，去除所有干擾離子而簡化質譜圖，從而能從復雜生物基質中快速檢測藥物代謝產物.但用于動物性食品中殘留獸藥代謝產物的研究尚未見報道.

本實驗通過收集小鼠灌胃給予磺胺二甲嘧啶獸藥后的血漿和尿液樣品，利用UPLC-Q-TOF/MS聯用技術，結合Masslynx Metabolynx XS輔助軟件，將Q-TOF/MS測定的準確質量用于鑒定和確認磺胺二甲嘧啶獸藥在動物體液中的代謝物.通過對磺胺二甲嘧啶獸藥在動物體液中代謝產物的研究，為更好地認識動物源性食品中獸藥及其代謝物的殘留提供科學的依據.

1實驗部分

1.1　實驗動物與樣品處理方法

1.1.1動物實驗方法

隨機選擇健康 ICR小鼠6只，8周齡，雌雄各半，體質量(28±5)g.其中1對雌雄作為空白，另外2對雌雄進行平行實驗.

給藥方案：健康小鼠實驗前禁食5 h，自由飲水.灌胃給磺胺二甲嘧啶0.5%(質量分數)的KCl生理鹽水混懸液(相當于30 mg/kg).給藥后繼續禁食5 h，自由飲水.每天早晚灌胃給藥各1次，每次1 mL，連續灌胃4 d.停藥后，收集ICR小鼠新鮮尿樣，于-20 ℃保存.停藥后，禁食8 h后眼眶取血，置含有肝素的試管，6 ℃離心(6 000 r/min，15 min)，取上層血漿，于-20 ℃保存.

1.1.2樣品的處理方法

準確移取體液樣品(200 μL)于10 mL離心管，加入1 mL酸性甲醇(pH 4.0)，渦旋混均1 min，靜止10 min，6 ℃離心(11 000 r/min，15 min)，將提取液轉移至已用3 mL甲醇和3 mL水活化的Oasis HLB固相萃取小柱(3 mL, 60 mg)，待淋洗液流干后，以3 mL甲醇洗脫，收集洗脫液置于50 ℃下氮吹至近干，以甲醇-水(體積比50∶50)溶解， 0.22 μm微孔濾膜過慮，轉移至自動進樣瓶，待UPLC-Q-TOF/MS分析.

1.2　儀器與試劑

超高液相色譜儀(ACQUITY UPLC?Ultra Performance LC，美國waters公司)；四極桿/飛行時間質譜儀(SYNAPT G2TMHDMS，美國waters公司)；MassLynxTM4.1軟件用于數據采集及處理；Acquity UPLCTMBEH C18色譜柱(50 mm×2.1 mm，1.7 μm，美國 waters公司)；TGL-16M高速冷凍離心機(湘儀)；MX-F渦流混合器(2 500 r/min, 美國 SCILOGEX，LLC公司)；SZ-97自動三重水蒸餾器(上海亞榮生化儀器廠)；Oasis HLB 固相萃取柱(3 mL, 60 mg, 美國waters公司)；0.22 μm尼龍膜(美國 Waters公司)

磺胺二甲嘧啶及其代謝物N4-乙酰磺胺二甲嘧啶購自加拿大TRC公司，純度均大于98%(質量分數).甲醇、乙腈和甲酸(色譜純，迪馬公司)；正己烷(分析純).

標準混合溶液包括10 μg/L的磺胺二甲嘧啶和200 μg/L的代謝物N4-乙酰磺胺二甲嘧啶.

1.3　UPLC色譜條件

Acquity UPLCTMBEH C18色譜柱(50 mm×2.1 mm×1.7 μm)；柱溫40 ℃；進樣量5 μL；流動相(A)是體積分數0.1%甲酸的水溶液；流動相(B)是體積分數0.1%甲酸的甲醇溶液.梯度洗脫條件見表1.

表1　流動相梯度洗脫程序

1.4　四極桿-飛行時間質譜(Q-TOF/MS)條件

最佳的Q-TOF/MS質譜條件:電噴霧離子源(ESI)：正離子模式ESI+，毛細管電壓3 kV，錐孔電壓35 V；萃取錐孔電壓4 V；脫溶劑氣溫度350 ℃；離子源溫度110 ℃；脫溶劑氣流速650 L/h；錐孔氣流速50 L/h；四極桿采集質量數30～800 u.數據采集模式：棒狀；參比溶液：2 μg/L亮氨酸腦啡肽(LE)；采集時間0.5 s；采集間隔時間10 s；掃描精確質量數556.2771(ESI+).分辨率>20 000 FWHM.

1.5　代謝產物的鑒定與分析

將磺胺二甲嘧啶可能的Ⅰ相代謝途徑如：還原、氧化、羥化等和可能的Ⅱ相代謝途徑如: 甲基化、乙酰化、磺酸化、葡糖醛酸化、磺酸化葡糖醛酸化等輸入MetaboLynx軟件Metabolite List窗口，同時定義質量缺陷過濾(mass defect filtering，MDF)窗口為50 mu，軟件自動根據采集的數據及設置的處理方法進行分析.通過MDF應用程序后，大部分內源性干擾離子會被除去，經過濾的數據有利于對藥物代謝物離子的鑒定.

2結果與討論

2.1　UPLC-Q-TOF-MS條件的優化

傳統的代謝物表征實驗，常采用反相液相色譜、緩慢的梯度洗脫以及長色譜柱，來確保生物基質中極性大于母藥的代謝物的保留及獲得足夠的分離.實驗選用Acquity UPLCTMBEH C18色譜柱(50 mm×2.1 mm，1.7 μm，waters)，由于UPLC優越的色譜分辨率和峰容量，大大減少了共洗脫成分的數目[10-12].磺胺類藥物含有易于和H+結合的帶有孤對電子的N或O原子，選擇ESI(+)作為電離模式，以酸性體系為流動相，分別考察了體積分數0.1 %甲酸-甲醇和體積分數0.1%甲酸-乙腈流動相對磺胺二甲嘧啶及目標代謝物N4-乙酰磺胺二甲嘧啶的分離、離子化效率和峰形的影響.與乙腈相比，采用甲醇作為流動相時，更有利于極性更大的代謝物的保留.如圖1給出了在ESI+模式下，50 μg/L磺胺二甲嘧啶及其目標代謝物N4-乙酰磺胺二甲嘧啶基質匹配標準混合液的總離子流色譜圖(total ion chromatograms，TIC)及提取離子色譜圖(extraction ion chromatograms，EIC).

圖1　在ESI+模式下，磺胺二甲嘧啶及其目標代謝物的總離子流色譜及提取離子色譜　Fig.1　TIC and EIC of sulfamethazine and its target metabolite under positive ion mode

2.2　磺胺二甲嘧啶原型藥物裂解規律解析

由于代謝物的質譜圖中通常含有一些和母體化合物相關的離子碎片，因此首先闡明原型獸藥磺胺二甲嘧啶在ESI源正離子模式下的裂解規律，為代謝物的結構鑒定提供依據.

在最佳的色譜-質譜條件下，增加源內碰撞誘導解離能量(collision-induced dissociation，CID)至25 V，獲得磺胺二甲嘧啶的質譜圖如圖2.采用ESI-Q-TOF/MSE質譜掃描，在低能量區原獸藥準分子離子峰[M+H]+對應的準確分子質量為m/z279.092 4，相應的化學式組成為C12H14N4O2S，質量誤差為0.6 mu.在高能量區其相應的二級碎片離子主要有m/z213，204，186，156，124和108，同時也顯示了少量的[M+Na]+(m/z301)離子峰.通過ESI-Q-TOF/MS測定了磺胺二甲嘧啶的準分子離子峰和相應碎片的準確相對分子質量，并且通過準確相對分子質量數得到了各個碎片的化學式組成和化學不飽和度(DBE)，結果列于表2.通過相應碎片離子的數據，給出了磺胺二甲嘧啶在正離子模式下的裂解途徑，結果見圖3.這些離子作為診斷離子用于鑒定磺胺二甲嘧啶的代謝物的結構.

圖2　在ESI+模式下，源內碰撞誘導解離能量至25 V時獲得磺胺二甲嘧啶的MS/MS　Fig.2　MS/MS spectra of sulfamethazine under positive ion mode and proposed CID 25 V

表2　磺胺二甲嘧啶及其碎片離子的質譜信息

圖3　在正離子模式下，磺胺二甲嘧啶裂解機理　Fig.3　Fragment pathway of sulfamethazine under positive ion mode

采用Metabolynx軟件將UPLC-Q-TOF/MSE采集的MS數據和MS/MS數據進行處理，該軟件以MDF處理為基礎，用于復雜生物基質中快速檢測藥物代謝物[10-11].通過與空白樣品比較，在給藥后小鼠的血漿樣品和尿液樣品中均發現了原型獸藥磺胺二甲嘧啶、目標代謝物N4-乙酰磺胺二甲嘧啶和多個非目標代謝產物，相應的主要代謝物的提取離子流色譜圖和原獸藥及目標代謝物的提取離子色譜見圖4.通過綜合分析每種代謝產物的保留行為、準分子離子和碎片離子，推測出磺胺二甲嘧啶在小鼠的血樣和尿樣中的代謝產物.所檢測到的母體磺胺二甲嘧啶及其在體液血漿和尿液中代謝產物的相關信息見表3.

根據所得原型獸藥磺胺二甲嘧啶、目標代謝物N4-乙酰磺胺二甲嘧啶和多個非目標代謝產物的多個離子碎片信息(包括精確分子質量和元素組成)，以表2給出的磺胺二甲嘧啶特征碎片離子作為診斷離子來推測磺胺二甲嘧啶在動物血樣和尿樣中代謝物的結構.

2.3.1原型獸藥M0的鑒定

通過單獨分析磺胺二甲嘧啶基質匹配標準品(圖1)，其母體藥物的保留時間是5.59 min，因此可以確認在血樣和尿樣中保留時間為5.59 min，且m/z279的峰是未被代謝的母體藥物.然而，在給藥之后的小鼠尿液m/z279的通道中在保留時間為5.61 min出現了另外一個色譜峰，Q-TOF質譜測定可知其精確分子質量為279.093 6(2.0 mu)，相應的化學式C12H14N4O2S，這與磺胺二甲嘧啶的質譜信息完全一樣.在分析尿樣中代謝物M4時，發現在代謝物M4的提取通道中同時共存保留時間為5.61 min且m/z279的峰，因此此峰被推斷為II相結合代謝物M4的源內裂解造成的.

圖4　磺胺二甲嘧啶在小鼠血漿和尿液樣品中主要代謝產物的色譜圖和原獸藥磺胺二甲嘧啶及目標代謝物N4-乙酰磺胺二甲嘧啶的提取離子色譜　Fig.4　Metabolites profile of sulfamethazine in mice plasma and urine, and extraction ion chromatogram of sulfamethazine and its target metabolite N4-acltysulfamethazine.

獸藥樣品代謝物反應化學式精確分子質量(m/z)誤差mu保留時間/min備注磺胺二甲嘧啶C12H14N4O2Sm/z279.0916血漿血漿M1→去甲基化C11H12N4O2S265.07691.04.81非目標MN→乙酰化C14H16N4O3S321.1010-1.15.86目標MN→乙酰化C14H16N4O3S321.1004-1.75.99目標M2→去甲基化+2×羥化-HNC11H11N3O4S282.0537-1.16.35非目標M3→2×羥化C12H14N4O4S311.0809-0.57.28非目標尿液M1→去甲基化-NNC11H16N2O5257.1127-1.01.66非目標M2→醇脫水-HNC12H11N3OS246.07474.64.52非目標M3→3×羥基化-HNC12H13N3O5S312.06620.85.62非目標MN→乙酰化C14H16N4O3S321.10270.65.82目標MN→乙酰化C14H16N4O3S321.1018-0.36.01目標M4→谷胱甘肽結合物-C6H7N3C16H22N4O7S2447.0917-9.16.67非目標

2.3.2目標代謝物MN的鑒定

通過分析目標代謝物N4-乙酰磺胺二甲嘧啶基質匹配標準品(圖1)，其保留時間是5.99 min，因此可以確認在血樣和尿樣中保留時間為5.9 min，且m/z321的峰是磺胺二甲嘧啶乙酰化代謝產物N4-乙酰磺胺二甲嘧啶.但是，在給藥之后的小鼠血樣和尿液m/z321的通道中同時出現保留時間為5.8 min的另外一個色譜峰，Q-TOF質譜測定可知其精確分子質量為321.102 7 (0.6 mu)，相應的化學式C14H16N4O3S，這與N4-乙酰磺胺二甲嘧啶的質譜信息完全一樣.實驗表明，N4-乙酰磺胺二甲嘧啶在體內代謝存在異構體現象.

2.3.3非目標代謝產物的鑒定

在血樣和尿樣中發現了一類羥基化代謝物，如血樣中M2m/z282和M3m/z311，尿樣中M3m/z312，其二級質譜中均顯示磺胺二甲嘧啶的主要碎片m/z108，124和156.表明這類代謝物多為磺胺二甲嘧啶母體的羥基化代謝產物.相對于血樣的代謝物，尿樣中的代謝物更復雜，代謝物M4在給藥后小鼠的尿液中被發現.代謝物M4的[M+H]+為m/z447，保留時間為6.67 min.在M4的二級質譜中發現特征中性丟失308 u(谷胱甘肽)和母體的特征碎片m/z156和124，因此判斷M4為母體碎片的谷胱甘肽結合物.

3結論

本研究采用UPLC-Q-TOF/MS聯用技術，運用Q-TOF質譜儀進行MS和MS/MS精確質量數的測定，得到相應碎片離子的分子式.依據精確質量數據，結合Metabolynx XS輔助軟件篩選出獸藥磺胺二甲嘧啶在小鼠血樣和尿樣的代謝產物.在血漿樣品中發現3個I相代謝物和1個II相代謝物；在尿液樣品中發現3個I相代謝物和2個II相代謝物.每個代謝物中至少含有2個碎片離子與母藥的碎片離子的信息相同，同時磺胺二甲嘧啶在體內代謝生成的目標乙酰代謝物存在異構現象.通過對雌性小鼠和雄性小鼠血樣和尿樣中代謝產物的對比分析，沒有顯出差別.

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(責任編輯：梁俊紅)