甘草對小鼠體外精原細胞分化的影響

金玉姬，潘曉燕，王肖娜，黃茜茜，吳湘軍，李青原，劉洋(吉林醫藥學院，吉林吉林132013)

甘草對小鼠體外精原細胞分化的影響

金玉姬，潘曉燕，王肖娜，黃茜茜，吳湘軍，李青原，劉洋
(吉林醫藥學院，吉林吉林132013)

摘要:目的觀察甘草對小鼠體外精原細胞分化的影響。方法取3只小鼠的新鮮睪丸切成組織塊后隨機分為5組，對照組不予處理，低濃度組、中濃度組、高濃度組分別加入終濃度為0.2、2.0、20.0 μmol/mL的甘草溶液，卵泡刺激素組加入等量卵泡刺激素培養液，培養3 d。采用免疫組化法觀察并計數精母細胞，計算精原細胞分化率。結果對照組、低濃度組、中濃度組、高濃度組和卵泡刺激素組精母細胞數分別為( 1.98±0.51)、( 67.23± 8.73)、( 82.57±9.27)、( 117.42±10.93)、( 109.93±11.13)個，精原細胞分化率分別為0.38%±0.06%、12.93% ±1.67%、15.87%±2.53%、22.37%±4.37%、20.97%±5.13%;與對照組比較，其他各組精母細胞數及精原細胞分化率均升高，P均＜0.01;低濃度組、中濃度組和高濃度組兩兩比較，P均＜0.01;高濃度組與卵泡刺激素組比較，P均＞0.05。結論甘草能促進小鼠體外精原細胞分化為精母細胞，并呈一定濃度依賴性。

關鍵詞:甘草;精母細胞;細胞分化;小鼠

甘草作為廣泛應用的中藥材，具有抗炎、抗氧化、抗腫瘤、調節免疫、解毒等作用［1～9］。我們之前的研究發現，甘草能促進在小鼠精子發生過程中精原細胞的增殖。精子發生過程很復雜，歷經精原細胞的增殖和分化、精母細胞的兩次減數分裂、精子細胞的產生等，其中減數分裂期是關鍵性的時間點［10］。聯會復合體蛋白( SCP)是初期減數分裂誘導轉錄因子，SCP3是其核心部分，SCP3表達對于第一次減數分裂的完成具有重要作用。2014年6～12月，我們觀察了甘草粗提取物對SCP3陽性的精母細胞數及精原細胞分化率的影響。

1　材料與方法

1.1材料甘草粗提取物購自瑞芬生物科技有限公司，甘草酸純度為20%;根據甘草酸的分子量配制成4 mmol/mL的甘草溶液，添加到2 mL的DMEM培養液中，配制成終濃度為0.2、2.0、20.0 μmol/mL的甘草溶液。健康6日齡SPF級雄性C57BL/6J小鼠3只，體質量( 3.85±0.36) g，由吉林農業大學動物資源開發中心提供;飼養室溫設定在21～23℃，相對濕度為55%±5%。所用器具全部經蒸壓( 121℃、30 min)及干燥處理( 100℃、4 h)。

1.2小鼠睪丸組織培養及分組處理于無菌操作臺上摘取小鼠睪丸;去除脂肪和附睪后，將睪丸切成0.5 mm×0.5 mm×0.5 mm的組織塊。將組織塊隨機分為5組，對照組不予處理，低濃度組、中濃度組高濃度組分別加入終濃度為0.2、2.0、20.0 μmol/mL的甘草溶液，卵泡刺激素組加入等量卵泡刺激素培養液，于32℃、5% CO2恒溫箱中培養3 d。培養結束后，用Bouin氏固定液固定。

1.3小鼠精原細胞分化情況觀察采用免疫組化法。將培養好的睪丸組織制作成石蠟切片，5 μm厚連續切片，取4個不同部位進行免疫組化染色。加入一抗抗SCP3抗體(美國Abcam Biotechnology公司) 4℃下孵育至少6 h，加入二抗(美國Amersham Biotechnology公司)于常溫下孵育1 h。用DAB和稀釋的蘇木精染色，細胞核呈茶色為SCP3陽性，即可判斷為精母細胞。隨機選取3張切片，計數100 000 μm2面積中的精母細胞數，并計算精原細胞分化率;實驗重復3次，取平均值。

1.4統計學方法采用SPSS16.0統計軟件。計量資料以珋x±s表示，多組間比較采用單因素方差分析( One Way ANOVA) ;兩組間比較，方差齊時用SNK檢驗( Student-Newman-Keuls法)，方差不齊時用Games-Howell檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2　結果

各組精原細胞分化情況比較，見表1。對照組幾乎無精母細胞分化，低濃度組、中濃度組、高濃度組、卵泡刺激素組均有分化的精母細胞。見插頁Ⅰ

圖5。

表1　各組精原細胞分化情況比較(珔x±s)

3　討論

研究證實，甘草具有很強的抗氧化活性。Li等［11］研究發現，異甘草素( ISL)能抑制白血病細胞增殖，可濃度依賴性地降低細胞內氧自由基水平，但不增加細胞凋亡率。在一定濃度和時間條件下，ISL可誘導HL-60細胞發生形態學改變，體現出典型的分化細胞特征，包括質核比的減少和腎型核細胞的增加。ISL能夠誘導白血病細胞中的單核細胞分化，有潛力成為白血病的治療藥物。

研究發現，用甘草提取物培養人類脫落乳牙干細胞( SHEDs)，可通過改變細胞形態、增加SHEDs分化成肝細胞的潛力，提示甘草提取物可作為肝損傷修復的治療藥物［12］。Fan等［13］研究發現，甘草總黃酮對慢性不可預測應激引起的大鼠抑郁行為具有明顯的抑制作用，并且在較大劑量下能對應激引起的海馬神經再生損害起到保護作用。甘草甜素( GL)可通過樹突狀細胞( DC)干擾免疫反應，參與多種免疫調節活動［14］。Bordbar等［15］研究表明，GL能上調小鼠脾臟DC的CD40、CD86和MHC-Ⅱ等成熟標志物的表達，使DC產生更多的IL-12。在混合淋巴球的反應中，被處理的DC刺激同種T細胞，并分泌細胞因子。DC經GL處理后可增加同種間T細胞的增殖，并產生IFN-γ、IL-10細胞因子、降低IL-4水平。這表明GL可影響T細胞的成熟和分化，并提高DC的活性。以上研究說明，ISL具有一定的促細胞分化作用，提示其在睪丸中也可能有這種作用。

本研究結果發現，與對照組比較，其他各組精母細胞數及精原細胞分化率明顯升高，且低濃度組～高濃度組呈一定濃度依賴性。說明甘草在精子發生過程中對精原細胞分化成精母細胞有明顯的促進作用，也可能起到減數分裂啟動的靶點作用。關于甘草提取物在精原細胞分化中的具體作用途徑及在睪丸中的作用位點仍有待于進一步研究。

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收稿日期:( 2015-01-09)

基金項目:吉林省科技發展計劃項目( 20130101147JC) ;吉林省大學生創新創業訓練計劃項目( 2013-846)。

文章編號:1002-266X( 2015) 32-0030-02

文獻標志碼:A

中圖分類號:R 321.1

doi:10.3969/j.issn.1002-266X.2015.32.011