嬰幼兒血管瘤源性血管內皮細胞系XPTS-1中p-Akt及Bcl-xL的表達及意義

陸宇，劉碩碩(泰州市第二人民醫院，江蘇泰州225599)

嬰幼兒血管瘤源性血管內皮細胞系XPTS-1中p-Akt及Bcl-xL的表達及意義

陸宇，劉碩碩
(泰州市第二人民醫院，江蘇泰州225599)

摘要:目的觀察活化的蛋白激酶B(p-Akt)及B細胞淋巴瘤/白血病-x基因長片段(Bcl-xL)在嬰幼兒血管瘤源性血管內皮細胞系(HemEC)XPTS-1中的表達變化并探討其意義。方法取處于對數生長期的XPTS-1細胞，經特異性PI3K/Akt信號通路抑制劑LY294002處理的XPTS-1作為實驗組，未經處理的XPTS-1作為對照組，采用流式細胞儀檢測兩組細胞周期分布和凋亡率，應用Western blotting法檢測p-Akt和Bcl-xL在各組中的表達。結果

實驗組G0/G1期細胞比例明顯增加(P＜0.01)，S期和G2/M期細胞明顯減少(P＜0.05);實驗組細胞凋亡率高于對照組(P＜0.01);實驗組p-Akt和Bcl-xL表達均比對照組明顯降低(P均＜0.01)。結論p-Akt及Bcl-xL在嬰幼兒血管瘤細胞中的表達明顯降低，二者可能在XPTS-1細胞凋亡中發揮重要作用。

關鍵詞:血管瘤;磷脂酰肌醇3激酶;磷酸化絲/蘇氨酸激酶; B細胞淋巴瘤/白血病-x基因長片段doi: 10.3969/j.issn.1002-266X.2015.33.009

嬰幼兒血管瘤(IH)是嬰幼兒較常見的良性腫瘤，根據血管瘤內皮細胞的生物學特點及臨床表現，血管瘤的病程可分為增生期、消退期和消退完成期［1，2］，關于其增生、消退的機制目前尚未闡明。磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)通路是細胞內重要的信號轉導通路，在諸多生物過程中發揮作用，包括細胞凋亡、新陳代謝、細胞的生長及增殖［3］，有研究［4］證實PI3K/Akt信號通路參與血管生成。LY294002是PI3K/Akt通路的特異性抑制劑，通過特異性抑制PIK3 p110亞單位的催化活性，可阻止PI3K的磷酸化過程，進而阻止通路的激活。B細胞淋巴瘤/白血病-x基因長片段(Bcl-xL)是公

認的抗凋亡蛋白，在惡性腫瘤中研究較多，血管瘤中研究較少，有文獻［5，6］報道，Bcl-xL可能參與血管形成。本研究中，我們通過阻斷PI3K/Akt信號通路后檢測嬰幼兒血管瘤源性血管內皮細胞系XPTS-1［7］細胞周期分布和凋亡率的變化及活化的Akt(p-Akt)、Bcl-xL表達，初步探討p-Akt及Bcl-xL蛋白在嬰幼兒血管瘤中的表達及意義。

1　材料與方法

1.1主要材料及試劑胎牛血清購于杭州四季青生物工程材料有限公司，DMEM培養基和RPMI1640培養基購于美國GIBCO公司，胰蛋白酶購于華美生物工程有限公司，DMSO購于天津永大化學試劑開發中心，LY294002購于美國Sigma公司，兔抗人p-Akt多克隆抗體購于美國NEOMARKERS公司，兔抗人Bcl-xL多克隆抗體購于美國NEOMARKERS公司，流式細胞儀試劑盒購于北京四正柏生物科技有限公司。

1.2嬰幼兒血管瘤內皮細胞的培養、鑒定及分組采用組織塊加酶消化法培養血管瘤內皮細胞。去除新鮮血管瘤標本上殘留的皮膚和脂肪組織，將瘤體剪成1～2 cm3的組織塊，0.25%胰蛋白酶37℃消化10～20min，將消化后的組織塊修剪成1mm3大小，接種于無菌培養瓶內，加入3mL含20%胎牛血清、70 μg/L VEGF、100mg/L肝素的DMEM培養基，37℃、5% CO2培養箱中孵育，4～5d后更換培養液。待組織塊周圍爬出內皮細胞較多時去除組織塊，更換培養液后繼續培養。細胞鋪滿瓶底后1∶2傳代培養。傳至16代時，換用RPMI1640培養基，繼續培養，建立嬰幼兒血管瘤XPTS-1細胞系［7］。細胞鑒定采用免疫組化法對Ⅷ因子相關抗原進行檢測。結果顯示血管瘤內皮細胞Ⅷ因子表達陽性。取處于對數生長期的XPTS-1細胞，分為實驗組、對照組。

1.3細胞周期檢測取培養的已傳代并貼壁的細胞，先用血清饑餓24 h，使細胞生長周期同步化;對照組XPTS-1細胞常規培養，實驗組參照文獻［8］加入50 μmol/L LY294002處理，繼續培養24 h，收集細胞，PBS洗2次，加入碘化丙啶(PI)，避光，4℃作用30min，用流式細胞儀檢測細胞周期。

1.4細胞凋亡率測算將LY294002處理24 h后的2組細胞，調整細胞濃度為1×106/mL，分別取1mL，PBS洗滌2次，棄上清，加入預冷的結合緩沖液100 μL重懸細胞，加入AnnexinV-FITC 5 μL和PI(20g/L)10 μL，混勻后于室溫避光孵育15min，在反應管中加入400 μL結合緩沖液，流式細胞儀分析細胞凋亡情況。

1.5 p-Akt和Bcl-xL表達檢測將LY294002處理24 h后的兩組細胞吸出培養液，PBS洗滌后每孔加入細胞裂解液50 μL提取總蛋白。以牛血清蛋白做標準品，測蛋白濃度。取50 μg總蛋白經10%聚丙烯酞胺凝膠電泳分離后，轉至硝酸纖維素膜上，5%脫脂牛奶(含0.1% Tween20)封閉1 h，加一抗(p-Akt 1∶1 000; Bcl-xL 1∶1 000)，室溫孵育過夜，洗膜，加辣根過氧化物酶標記的二抗室溫孵育2 h，洗膜，ECL顯色，暗室中曝光，顯影，定影，保存膠片，掃描分析p-Akt和Bcl-xL表達情況。

1.6統計學方法采用SPSS13.0統計軟件。計量資料以珋x±s表示，組間比較用t檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2　結果

2.1兩組細胞周期分布比較G0/G1期細胞比例明顯增加(P＜0.01)，S期和G2/M期細胞明顯減少(P＜0.05)，細胞生長被阻滯于G0/G1期，見表1。

表1　兩組處理24 h后XPTS-1細胞周期分布(%，)

表1　兩組處理24 h后XPTS-1細胞周期分布(%，)

注:與對照組比較，△P＜0.05，*P＜0.01。

組別　各期細胞比例G0/G1期　S期　G2/M期實驗組78.63±5.26　19.51±2.82　1.60±0.74對照組　61.89±3.28*　32.75±2.17*　5.07±1.19△

2.2兩組細胞凋亡率比較對照組和實驗組的細胞凋亡率分別為(0.27±0.14)%、(34.72± 0.51)%，兩組比較，P＜0.01。

2.3兩組p-Akt和Bcl-xL表達比較對照組和實驗組中p-Akt的表達強度分別為0.97±0.22、0.21 ±0.07，Bcl-xL的表達強度分別為0.59±0.11、0.12 ±0.03，實驗組與對照組兩種蛋白表達強度差異均有統計學意義(P均＜0.01)。

3　討論

IH是嬰兒期常見的良性腫瘤，其特點為異常血管的迅速增長。直至目前其增生和退化的細胞及分子機制尚未完全闡明。目前IH的治療方法主要有口服或局部注射糖皮質激素、放療、激光［9］、口服α-干擾素、硬化劑局部注射［10］及手術等，但均有不同程度不良反應，尋求新的治療方法成為目前研究的熱點。

Akt又名蛋白激酶B，是一種絲氨酸/蘇氨酸激酶，位于PI3K/Akt信號傳導通路的中心環節，Akt的活化依賴PI3K對磷脂酰肌醇環上3位羥基的特異磷酸化，p-Akt通過磷酸化下游的靶蛋白發揮促進細胞增殖、抑制細胞凋亡、化療耐受等作用［11］。

p-Akt能調節細胞周期G1/S時相轉換，其機制是通過使失活，增加cyclin-D1轉錄，磷酸化p21、p27等實現［12］。本實驗結果發現，阻斷PI3K/Akt信號通路后G0/G1期細胞比例比對照組明顯增加，p-Akt表達明顯降低，表明通路阻斷后，活化的Akt減少，調節細胞G1/S期的作用不能發揮，細胞被阻滯于G0/G1期。

Bcl-2家族在細胞凋亡過程中發揮重要的調控作用，其成員包括抗凋亡因子和促凋亡因子，調節多細胞機體的發展及組織的動態平衡［13］。Bcl-x是Bcl-2家族的成員，是1993年Boise等［14］以鼠Bcl-2 的cDNA為探針從雞淋巴細胞cDNA文庫中篩選到的一個克隆，激活后有雙重調節作用，因其mRNA的第一個外顯子5'端剪接位點不同而存在兩種大小不同的片段，即表達長片段的Bcl-xL及短片段的Bcl-xS，Bcl-xL在細胞質中通過與Bax形成異源二聚體抑制細胞凋亡。近年來，Bcl-xL在腫瘤發生發展中的作用受到較多關注，如前列腺癌［15］、肺癌［16］等。本研究結果發現，阻斷PI3K/Akt信號通路后，XPTS-1細胞的凋亡率明顯增加，p-Akt和Bcl-xL表達均降低。表明PI3K/Akt信號通路與IH細胞的增生、凋亡可能存在某種關系，且抗凋亡因子Bcl-xL亦在其中發揮重要作用。根據國內外研究結果提示，p-Akt可能是通過磷酸化NF-κB，激活其轉錄功能，促進Bcl-xL表達［17］，一旦p-Akt的活性被抑制，Bcl-xL表達亦會下降，從而其抗凋亡作用受到抑制。

綜上所述，PI3K/Akt信號通路及其下游的BclxL在嬰幼兒血管瘤細胞的凋亡中發揮重要作用，據此推測嬰幼兒血管瘤的增生、消退很可能與PI3K/ Akt通路的激活與抑制及Bcl-xL的表達高低有關系。本研究為以PI3K/Akt信號通路為靶點的治療方法提供了實驗依據，亦為今后嬰幼兒血管瘤增生、消退機制更進一步的研究提供了新思路，但細胞內的信號轉導通路錯綜復雜，涉及因子很多，嬰幼兒血管瘤的發病機制仍需更深入地研究去完善。

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收稿日期:( 2015-04-10)

文章編號:1002-266X(2015)33-0027-03

文獻標志碼:A

中圖分類號:R732.2