UPLC-MS/MS 法測定比格犬血漿中雙氯芬酸鈉的濃度

向志雄劉文麗（上海醫藥集團股份有限公司中央研究院 上海 201203）

UPLC-MS/MS 法測定比格犬血漿中雙氯芬酸鈉的濃度

向志雄*劉文麗
（上海醫藥集團股份有限公司中央研究院 上海 201203）

摘 要目的：建立靈敏的超高效液相色譜-質譜聯用法測定比格犬血漿中的雙氯芬酸鈉的濃度。方法：選用BEH C18（2.1 mm×100 mm, 1.7 mm）色譜柱，以乙腈-醋酸銨（2 mmol·L-1）-甲酸（70∶30∶0.1，v/v/v）為流動相，采用等度洗脫進行分離，樣品采用含0.1% 甲酸的乙腈進行蛋白沉淀后進樣，通過電噴霧電離源, 以多重反應監測（MRM）方式進行負離子檢測, 用于定量分析的離子對為m/z （293.9+293.9+296.1）→（249.9+213.7+251.8） (雙氯芬酸)和m/z 283.0→239.0（內標, 大黃酸）測定雙氯芬酸鈉。結果：雙氯芬酸鈉的線性范圍為：1.0 ~ 3 000.0 ng·ml-1；定量下限可達1.0 ng·ml-1；日內、日間精密度（RSD）均小于15 %。結論: 本方法同時選擇3個碎片離子作為雙氯芬酸鈉定量產物離子，明顯的改進了分析方法的靈敏度, 血漿用量少,適用于比格犬血漿樣品中雙氯芬酸鈉的測定和藥物動力學研究。

關鍵詞超高效液相色譜-質譜聯用法 雙氯芬酸鈉 比格犬血漿樣品檢測 血藥濃度

文獻標示碼：A

UPLC-MS/MS determination of the diclofenac sodium (DS) in dog plasma

XIANG Zhixiong*, LIU Wenli
(Central Research Institute, Shanghai Pharmaceuticals Holding Co. Ltd., Shanghai 201203, China)

ABSTRACTObjective: To develop a UPLC-MS/MS method for determination of diclofenac sodium (DS) in dog plasma. Methods: DS and internal standard were extracted from plasma by acetonitrile containing 0.1% formic acid and separated on a column BEH C18（2.1 mm×100 mm, 1.7 mm）using acetonitrile-ammonium acetate (2 mmol·L-1)-formic acid (0.1%) (70∶30∶0.1, v/v/v) as a mobile phase. A tandem mass spectrometer equipped with electrospray ionization source was adopted as a detector. Multiple reaction monitoring (MRM) transitions of m/z (293.9+293.9+296.1) →(249.9+213.7+251.8), m/z 283.0→239.0 were measured in negative mode for DS and internal standard rhein, respectively. Results: The calibration curve for DS was linear over the range of 1.0~3 000.0 ng·ml-1and the lower limit of quantification was 1.0 ng·ml-1with the relative standard deviation of intra-day and inter-day over the entire concentration range less than 15%. Conclusion: This method is sensitive and suitable for pharmacokinetic study of DS in dog subjects.

KEY WORDSUPLC-MS/MS; diclofenac sodium; Beagle dog plasma sample testing; plasma concentration

雙氯芬酸鈉雙釋放腸溶膠囊（diclofenac sodium，DS）是一種非甾體抗炎藥，它具有獨特的雙釋放系統，主要通過抑制前列腺素合成而發揮抗風濕、消炎、鎮痛及解熱作用。臨床上常用于類風濕性關節炎、肌腱炎、骨關節炎、滑囊炎及其他關節或關節周圍疾患的消炎及鎮痛[1]。有關雙氯芬酸鈉血藥濃度的測定方法，國內外報道主要有 HPLC-UV、GC、LC-MS、LC-MS/MS 和UPLC-MS/MS法[2-8]，分析時間較長，前處理方法有蛋白沉淀、液-液萃取、固相萃取，血漿需求量一般比較大（0.1~2.0 ml），靈敏度較低（2.5～80 ng·ml-1）。有關比格犬血漿中雙氯芬酸鈉的超高效液相色譜-質譜聯用測定方法，尚未見文獻報道，僅有一篇關于兔血漿中雙氯芬酸鈉的超高效液相色譜-質譜聯用測定的報道[8]。本實驗擬建立快速、靈敏、專屬性強的UPLC-MS/MS法，測定比格犬血漿樣品中雙氯芬酸鈉的濃度。

1 儀器與試藥

API 4000 QTRAP 型串聯質譜儀，配有電噴霧離子化源（ESI）以及Analyst 1.5.1數據處理軟件（美國Applied Biosystem 公司）；Waters Acquity UPLC系統，

包括二元輸液泵，自動進樣器（美國Waters公司）。

雙氯芬酸鈉標準品（Sigma，批號： 075k1896）；大黃酸標準品（中國藥品生物制品檢定所，批號： 110757-200206）；乙腈（色譜純，Merck公司）；醋酸銨（色譜純，Tedia公司）；甲酸（色譜純，CNW公司）；其余試劑均為市售分析純級試劑；實驗用水為去離子超純水；空白Beagle 犬血漿，由復旦大學藥學院實驗中心提供。

2 方法與結果

2.1 溶液的配制

DS儲備液：精密稱取雙氯芬酸標準品3.21 mg，加1 605 ml 50%甲醇溶液溶解，搖勻，配制成質量濃度為2 000 mg· ml-1的雙氯芬酸儲備液。

DS標準系列溶液：取DS儲備液適量，用乙腈水溶液稀釋配制成DS濃度為60，54， 20，6，2，0.6，0.2，0.04，0.02 mg· ml-1的標準溶液。

內標溶液：精密稱取大黃酸標準品1.88 mg，加200 ml DMSO溶解并加740 ml 乙腈稀釋，搖勻，配制成質量濃度為2 000 mg· ml-1的大黃酸儲備液，取適量的大黃酸儲備液用含0.1% 甲酸的乙腈稀釋到濃度為10.0 ng·ml-1。

2.2 色譜條件

色譜柱：BEH C18（2.1 mm×100 mm，1.7 mm，Waters 公司）；流動相：乙腈-2 mmol·L-1醋酸銨-甲酸（70∶30∶0.1，v/v/v）；流速：0.3 ml·min-1；分析時間：2 min; 柱溫：25 ℃；自動進樣器溫度：4 ℃；進樣量：5 ml。

2.3 質譜條件

離子源：電噴霧離子源（ESI）， 負離子方式檢測；離子源電壓（IS）： -4 500 V； 離子源溫度（TEM）： 500℃；霧化氣（Gas 1，N2）壓力： 345 kPa；輔助氣（Gas 2，N2）壓力： 345 kPa；氣簾氣（CUR） 壓力： 138 kPa；掃描方式為多重反應監測 （MRM）；碰撞氣（CAD，N2）壓力：Medium；用于定量分析的離子反應分別為m/z （293.9+293.9+296.1）→（249.9+213.7+251.8） （DS，DP電壓：-47 V，-47 V ， -53 V ，CE電壓：-18 V，-30 V，-15 V；CXP電壓：-13 V，-15 V，-15 V），和m/z 283.0→239.0 （大黃酸， DP電壓：-80 V，CE電壓：-22 V；CXP電壓：-17 V）。

2.4 血漿樣品處理

精密取血漿樣品50 ml至1.5 ml EP管中，加入400 ml內標溶液，混勻后離心10 min（15 200 轉/min），取上清液進樣5 ml進行UPLC-MS/MS定量分析。

2.5 分析方法確證

2.5.1 質譜分析

將DS儲備液用乙腈水稀釋到1 μg·ml-1，內標用乙腈稀釋到1 μg·ml-1，采用蠕動泵進樣模式，分別進行碎片離子分析，相應的二級全掃描質譜圖見圖1。

圖1 二級全掃描質譜圖

2.5.2 方法的專屬性

分別取空白血漿，加入DS標準溶液和內標溶液的空白血漿，受試動物給藥后收集的血漿樣品100 ml，按照上述“2.4”項下操作及檢測條件進行定量分析，得色譜圖2。結果表明：內源性物質不干擾測定。

圖2 DS和內標大黃酸的選擇離子色譜圖

2.5.3 線性關系

取空白血漿190 ml，加入DS標準系列溶液10 ml，配制成相當于血漿濃度為1.0，2.0，10.0，30.0， 100.0，300.0，1 000.0，2 700.0，3 000.0 ng·ml-1標準曲線樣品。分別按照“2.4”項下操作后進樣分析。以血漿中待測物濃度為橫坐標X （ng·ml-1）， 待測物與內標物的峰面積比值為縱坐標Y，用加權（W =1/X2）最小二乘法進行回歸計算，求得DS直線回歸方程為：Y=0.030 2X+0.017 4，r =0.997。

根據工作曲線，DS在1.0 ~ 3 000.0 ng·ml-1范圍內線形關系良好。DS的定量下限為1.0 ng·ml-1。

2.5.4 準確度與精密度

按“2.4”項下操作，制備DS低、中、高濃度分別為3.0，600.0，2 400.0 ng·ml-1的質量控制（QC）樣品，計算方法的準確度與精密度，結果見表1。

表1 血漿中雙氯酚酸鈉UPLC-MS/MS測定方法的準確度與精密度（n=18）

2.5.5 提取回收率和基質效應

按“2.4”項下操作，制備低、中、高3個濃度的對照品血漿，每個濃度6個樣品。同時另外取空白血漿50 ml，加入沉淀劑含0.1% 甲酸的乙腈、混勻后離心10 min （15 200 轉/min），向獲得的上清液中加入相應濃度的標準溶液和內標溶液，渦流混勻，進樣5 ml進行UPLCMS/MS分析，獲得相應峰面積，以每一濃度2種處理方法的峰面積比值計算提取回收率，雙氯酚酸鈉低、中、高3個濃度的提取回收率±RSD分別為：（85.4±12.2）%，（89.2±8.6）%，（79.0±6.4）%；內標大黃酸的提取回收率為 （86.2±5.4）%。實驗中對DS和大黃酸的基質效應進行了考察，結果相對偏差RE均小于15%，表明血漿無明顯基質效應存在。

2.5.6 穩定性考察

考察了DS低、中、高濃度分別為3.0、600.0、2 400.0 ng·ml-1在不同條件下的穩定性（n=6）。結果表明：DS室溫放置6 h穩定（RE 分別為：14.1%，3.4.%，-5.6%），預處理后自動進樣器放置24 h穩定（RE 分別為： 14.0 %，8.8 %，0.3 %），3 次凍融循環穩定（RE 分別為：-5.2 %，-12.6 %，7.6 %），-70 ℃放置24 d穩定（RE 分別為：6.8 %，13.5 %，8.6 %）。

2.5.7 稀釋效應驗證試驗

本方法中DS的線性范圍為1.0 ~ 3 000.0 ng·ml-1，對于濃度超出線性范圍的樣品，用空白比格犬血漿稀釋后再測定，因此進行了稀釋效應驗證試驗。配制DS濃度為24 000 ng/ml的6份血漿樣品，精密吸取5 ml，加入空白血漿45 ml，混勻。按“2.4”項下操作后進樣分析，結果準確度為106.7%，RSD=2.42%，表明血漿樣品稀釋對測定結果沒有影響。

2.6 方法學應用

未知血漿樣品測定按 “2.4”項下操作，每個分析批

建立一條標準曲線，同時分析低、中、高多樣本的質控樣品（雙氯芬酸血漿濃度分別為3.0，600.0，2 400.0 ng·ml-1），并穿插于受試者樣品測定中。根據當批標準曲線求算未知血漿樣品濃度和質控樣品濃度，至少67 %的質控樣品的相對偏差在±15%之內，此批數據方可接收。應用本研究所建立的方法測定8條Beagle犬單劑量灌胃雙氯芬酸鈉雙釋放腸溶膠囊（戴芬，規格75 mg/粒）1粒后血藥濃度-時間曲線見圖3。各受試動物24 h前各點血藥濃度均能檢測到，本方法可以滿足Beagle犬藥物動力學研究。

圖3 8只比格犬灌胃雙氯芬酸鈉雙釋放腸溶膠囊1粒后DS的平均血藥濃度-時間曲線

3 討論

用UPLC-MS/MS測定血藥濃度，具有選擇性好、靈敏度高、分析時間短等優點，已普遍地應用于藥物動力學研究。最新文獻報道UPLC-MS/MS法測定兔血漿中雙氯芬酸用ESI源，并采用1個響應穩定的主要粹片離子作為雙氯芬酸定量分析的產物離子，1個響應穩定的粹片離子作為雙氯芬酸鈉定性分析的產物離子，但是定量下限只能達80 ng·ml-1[8]。本實驗同樣選用ESI源，考慮到雙氯芬酸鈉中含有氯同位素，同時采用3個響應穩定的主要粹片離子作為雙氯芬酸定量分析的產物離子，定量下限可達1 ng·ml-1，大大提高了本方法的靈敏度。

分別嘗試用甲醇和乙腈作為流動相中的有機相，結果表明后者背景噪音較低，且響應約為前者的兩倍，在流動相中加入甲酸和醋酸銨可使待測物的相應增加，峰形得到改善。在有效避免離子抑制與內源性物質干擾的前提下、為了達到更快的分析速度（本實驗一個樣品分析時間僅2 min），最終選用乙腈-2 mmol·L-1醋酸銨-甲酸（70∶30∶0.1，v/v/v）為流動相，流速為0.3 ml·min-1。與文獻[8]比較，本法在流動相都為酸的情況下，當濃度相同時，甲酸比乙酸的響應高，加入緩沖鹽，響應更穩定。對比了一些文獻應用的內標非那西汀，發現大黃酸在所選用的色譜條件下，不僅峰形好、響應穩定，而且和雙氯芬酸鈉的保留時間比較接近。

文獻報道的雙氯芬酸鈉血漿樣品處理方法有蛋白沉淀法、液-液萃取法、固相萃取法等。固相萃取法成本較高，液-液萃取法比沉淀蛋白處理繁瑣，本實驗在不影響靈敏度的前提下，采用了同文獻[8]相同的蛋白沉淀法，并在優化沉淀條件時，對沉淀試劑進行了考察。血漿樣品在不同體積0.1% 甲酸的作為酸化試劑的條件下，分別經甲醇、乙腈溶劑進行沉淀，通過UPLC-MS/MS進行分析，發現以400 ml含0.1% 甲酸的乙腈為沉淀試劑時，提取回收率高且提取穩定。

綜上，本研究所建立的方法，分析時間短，實驗所需血漿量少，快速、靈敏、專屬性強，可用于Beagle犬藥物動力學實驗，可為雙氯芬酸鈉的臨床藥代動力學提供參考。

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收稿日期：（2015-01-05）

作者簡介：*向志雄（1978-），男，工程師，主要從事藥物分析和藥物代謝動力學方面的工作。E-mail: xiangzx@sphchina.com

文章編號：1006-1533(2015)05-0074-04

中圖分類號：R969.1; R971.1