骨形態發生蛋白-6對過氧化氫造成的視網膜色素上皮細胞損傷的保護作用

陳　麗，劉　明，劉　勇，張德秀

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·實驗研究·

骨形態發生蛋白-6對過氧化氫造成的視網膜色素上皮細胞損傷的保護作用

陳麗1，劉明2，劉勇3，張德秀1

Protective effect of bone morphogenetic protein 6 on RPE cells injury caused by H2O2

Citation:Chen L, Liu M, Liu Y,etal. Study of the protective effect of bone morphogenetic protein 6 on RPE cells injury caused by H2O2.GuojiYankeZazhi(IntEyeSci) 2016;16(1):37-40

摘要

目的：觀察骨形態發生蛋白-6(bone morphogenetic protein，BMP-6)對過氧化氫(hydrogen peroxide，H2O2)作用的人視網膜色素上皮株ARPE-19細胞的細胞形態、增殖以及凋亡的影響。

方法：常規培養ARPE-19細胞，分為正常對照組、75μmol/L H2O2及150ng/mL BMP-6、75μmol/L H2O2+150ng/mL BMP-6環境中培養3、6、9、12h后，MTT比色法檢測細胞的活性；流式細胞儀檢測細胞的周期及凋亡變化。

結果：H2O2作用組的細胞活性隨著作用時間的延長逐步降低；而BMP-6+H2O2組的細胞活性則較H2O2組高，在3h及6h時兩組相比差異有統計學意義(P<0.05)；細胞形態觀察發現：H2O2培養6h后，細胞數量減少，細胞發生脫落，而添加BMP-6后細胞脫落及凋亡均要明顯減少。

結論:BMP-6可以一定程度上保護視網膜色素上皮受到氧化應激的損傷。

關鍵詞：骨形態發生蛋白-6；氧化應激；年齡相關性黃斑變性；過氧化氫

引用：陳麗，劉明，劉勇，等.骨形態發生蛋白-6對過氧化氫造成的視網膜色素上皮細胞損傷的保護作用.國際眼科雜志2016;16(1):37-40

0引言

年齡相關性黃斑變性(age-related macular degeneration，AMD)是一項進行性地損傷中央視力的疾病，可以導致光感受器細胞和視網膜色素上皮的變性，進而導致脈絡膜新生血管突破Bruch’s膜[1]。大量研究結果提示，氧化應激是AMD發生和發展的一個重要的促進因素[2]。在AMD患者中，視網膜中鐵的聚集可以加劇它的病程[3]。已有研究證實，骨形態發生蛋白-6(bone morphogenetic protein-6，BMP-6)是系統性鐵的主要調節因子[4]。BMP-6可否保護視網膜色素上皮細胞(retinal pigment epithelial cells，RPE)使其免受氧化應激的損傷鮮見報道。本實驗擬進一步研究BMP-6對RPE細胞的抗氧化作用，探討BMP-6用于防治AMD的可能性。

1材料和方法

1.1材料人視網膜色素上皮細胞(RPE細胞株購自美國ATCC公司)，DMEM培養基(美國Sigma)，胎牛血清(FBS，美國Hyclone，USA)，胰蛋白酶(Amersco，USA)，過氧化氫(遠大過氧化物有限公司，上海)，骨形態發生蛋白-6(BMP-6，美國Sigma)；流式細胞儀(型號FACS Calibur，BD公司,USA)。

1.2方法

1.2.1細胞培養及分組ARPE-19細胞培養：取出裝有ARPE-19細胞株的細胞凍存管，迅速置于37℃水浴中解凍，將細胞懸液移入離心管中，加入5mL含15%新生牛血清的DMEM/F12培養液，1 000r/min離心5min，棄上清，加入5mL含15%新生牛血清的DMEM/F12培養液，經細胞計數，調整細胞濃度為5×104個/mL，接種入50mL細胞培養瓶中，將其置于5% CO2，95%空氣、濕度90%的CO2培養箱中培養，24h后觀察細胞情況。取生長狀態良好的細胞，常規DMEM培養，次日貼壁生長后更換為無血清培養液培養24h后，分為：(1)正常對照組；(2)H2O275μmol/L組；(3)H2O275μmol/L+BMP-6作用組(150ng/mL)；(4)BMP-6(150ng/mL)作用組；各作用0、3、6、9、12h。

1.2.2細胞的形態學觀察RPE細胞消化、傳代后以1×104個/孔的細胞密度接種于6孔板中，靜置培養24h后吸棄上清，更換為無血清培養液，同步化處理24h，分為正常對照組、H2O2組、BMP-6組及H2O2+BMP-6組作用3、6、9、12h。在倒置相差顯微鏡下觀察各組細胞的形態學變化，并采集圖像。

1.2.3 MTT法測定細胞的活性將RPE細胞以5×104個/mL細胞密度接種于96孔板中，次日貼壁生長后按照實驗分組加入試劑：(1)氧化損傷組加入H2O275μmol/L，(2)H2O275μmol/L+BMP-6(150ng/mL)作用組，(3)BMP-6(150ng/mL)作用組，各作用0、3、6、9、12h。呈色：每孔加MTT溶液(5mg/mL，用pH=7.4的PBS配)20μL。繼續孵育4h，終止培養，小心吸棄孔內培養上清液，對于懸浮細胞需要離心后再吸棄孔內培養上清液。每孔加150μL DMSO，置于搖床上低速振蕩使結晶物充分融解。比色：選擇492nm波長，在酶聯免疫監測儀上測定各孔光吸收值，記錄結果，以時間為橫坐標、吸光值為縱坐標繪制細胞增殖曲線。

1.2.4流式細胞儀測定細胞的周期及凋亡變化分組：(1) 正常對照組；(2)氧化損傷組加入H2O275μmol/L；(3)H2O275μmol/L+BMP-6(150ng/mL)作用組；(4)BMP-6(150ng/mL)作用組，作用12h。收集細胞，1 000r/min離心5min，棄上清液。用PBS溶液清洗3次，用70%乙醇混勻固定，4℃過夜，PBS再清洗細胞 30min，在離心管中留1mL PBS，仔細打散細胞團，加入RNase A 5μL(1mg/mL)，37℃溫浴30min，加入500μL含50μg/mL溴化乙錠的PBS，室溫避光30min，流式細胞儀檢測細胞周期分布情況及凋亡情況，獲取軟件：CellQuest Pro；分析軟件：Modifit LT。重復3次。

圖1H2O2及H2O2+ BMP-6不同作用時間組細胞活性的比較aP<0.05vs同時間點H2O2組;bP<0.01vs同組0h。

2結果

2.1細胞活性分析MTT法檢查結果(圖1)顯示，在作用3、6、12h時方差齊性檢驗均為P>0.05，表示具有方差齊性，所以多重比較采用LSD-t檢驗，在作用3、6、12h時組間差異均有統計學意義(P<0.05)；而組內比較發現：在3h和6h時H2O2與H2O2+BMP-6比較差異有統計學意義(P<0.05)，而在12h時H2O2與H2O2+BMP-6比較差異無統計學意義(P=0.928>0.05)。在9h作用組行方差齊性檢驗發現P=0.01<0.05，表示不具有方差齊性，所以多重比較采用Tamhane’s檢驗，結果在作用9h時組間差異均有統計學意義(P<0.05)，在作用9h時H2O2組與H2O2+BMP-6組比較差異無統計學意義(P=0.946>0.05)。

2.2 RPE細胞形態的變化倒置相差顯微鏡下觀察，正常的人RPE傳代后4h開始呈貼壁生長，貼壁良好的細胞呈紡錘形或梭形，細胞內顆粒分布均勻(圖2A)。可見，H2O2作用組，RPE細胞的細胞體皺縮、變圓，呈空泡狀，部分細胞脫壁(圖2H6)。而單純BMP-6作用組可看到細胞狀態良好，細胞密度變大(圖2B6)。而添加BMP-6的H2O2作用組可以看到細胞體皺縮，變圓空泡現象較單純H2O2組有所改善(圖2HB6)。

2.3流式細胞分析細胞周期及凋亡的結果各組作用12h后，用流式細胞分析細胞周期及凋亡。由表1及圖3可以看出，正常對照組、H2O2組、BMP-6組、H2O2+BMP-6組作用12h時凋亡率分別為4.83%、32.63%、4.86%、23.67%；進行方差齊性檢驗發現具有方差齊性，組間比較采用LSD-t檢驗：BMP-6組與正常對照組無統計學差異(P=0.97>0.05)；其余兩兩比較均有統計學差異(均P<0.05)。可以看出，H2O2可以加劇視網膜色素上皮細胞的凋亡，單獨添加BMP-6作用后凋亡率與正常對照組無統計學差異，而BMP-6則可以對抗H2O2促進視網膜色素上皮細胞的凋亡作用。細胞周期的分析中我們可以看出，H2O2組G2+S期的細胞比例明顯增加，而G1期的比例明顯降低。

3討論

年齡相關性黃斑變性(age-related macular degeneration，AMD)是與年齡相關的視網膜脈絡膜中心區域(黃斑區)的光感受器-視網膜色素上皮(RPE)-Bruch膜-脈絡膜毛細血管復合體的進展性病變，可導致中心視力的喪失。AMD嚴重影響生活質量，由于中心視力喪失，患者生活不能自理，同時造成沉重的社會經濟負擔。目前AMD的病理過程并不是很清楚，認為與氧化應激及炎癥有關。視網膜組織由于耗氧量高、富含多不飽和脂肪酸、且暴露于光照，成為氧化應激的高度易感部位[5]。

圖2RPE細胞形態的變化(×200)A：正常對照；H3：H2O2組3h；H6：H2O2組6h；B3：BMP-6組3h；B6：BMP-6組6h；HB3：H2O2+ BMP-6組3h；HB6：H2O2+ BMP-6組6h。

圖3培養12h后各組細胞周期及凋亡的檢測結果A：對照組；B：H2O2組；C：BMP-6組；D：H2O2+BMP-6組。

表1各組作用12h后RPE 細胞周期各時期比例的變化

，%，n=3)

aP<0.05vs正常對照組。

過氧化氫是一種重要的活性氧，外源性過氧化氫極易通過細胞膜進入細胞，在細胞內過渡金屬存在時通過Fenton反應，形成高活性的自由基，如單態氧、羥自由基等，進一步造成細胞損傷。因其操作簡單，容易控制，現廣泛用于體外模擬細胞的過氧化損傷實驗[6]。鐵是一種潛在的氧化劑，過量的鐵可以啟動Fenton反應，催化H2O2形成羥自由基，進而導致脂質過氧化、DNA鍵斷裂、細胞降解，導致組織破壞[7]。

在視網膜中，光傳導級聯反應中涉及多種鐵相關蛋白。RPE65，在RPE中表達的與鐵相關的蛋白，在視覺循環中負責所有酯轉化為11順式視黃醇。光感受器細胞不斷地流出及合成它們的外節盤,因而很大程度依賴于脂肪酸去飽和酶(一種膜脂質合成所必須的鐵相關蛋白)。同其他細胞一樣，視網膜細胞容易受到過量鐵導致的氧化應激的損害。過量鐵可以損害RPE的吞噬作用。鐵是鳥苷酸合成cGMP(光傳導途徑的二級信使)所必須的。長期暴露于光線，光致氧化作用在視網膜中產生了超過正常水平的反應氧化產物。二十二碳六烯酸，這種組織豐富的多元不飽和脂肪酸，易受脂質過氧化反應的影響在自由基之前，進而影響視網膜的功能。基于這些原因，鐵平衡的調節在視網膜中有很重要的作用，鐵平衡的破壞將產生嚴重的生物及臨床后果[8]。

骨形態發生蛋白(bone morphogenetie proteins，BMPs)是一組具有類似結構的高度保守的功能蛋白，它們最初是作為能夠在體內誘導骨和軟骨形成的因子為人們所認識的。但隨著分子生物學研究的深入，對BMPs家族成員的研究日益深入和擴展，已發現BMPs廣泛分布于人體多種組織和細胞，對靶細胞的生長、分化以及凋亡具有調控作用，在機體胚胎生長發育、創傷愈合、機體腫瘤的發生發展等過程中起重要作用[9]。有研究表明，BMPs在眼的發育和眼疾病中發揮著重要作用，參與視覺系統發生、發展的各個階段。BMP-6具有獨特的結構及功能特征，其作用復雜，參與調節體內多種代謝過程，不僅在維持生理功能上具有重要作用，而且還介導了許多疾病的發生，因此對BMP-6的研究越來越受人們的重視[10]。

新近研究發現，BMP-6是影響機體鐵代謝的重要調節因素。這一發現不僅豐富了機體鐵代謝及其調控的理論知識，還可嘗試運用BMP-6的調控作用治療鐵代謝相關疾病[11]。在鼠眼內進行BMP-6蛋白注射，可以上調鐵調素進而改變視網膜鐵的水平。BMP-6敲除小鼠會產生劑量依賴性的視網膜內鐵的積聚和變性[12]。尸檢發現，早期黃斑變性患者視網膜色素上皮細胞中BMP-6的水平明顯下降。早期AMD中BMP-6水平的降低可以導致在AMD中鐵離子的集聚[13]。Majda等[14]研究發現，在體內及體外，氧化應激可以下調BMP-6 mRNA的表達。運用H2O2作用于體外培養的RPE后，BMP-6 mRNA的表達明顯下降。

既然氧化應激導致的BMP-6的下調已被證實與AMD有關。那么體外添加BMP-6可否保護RPE細胞受到氧化應激的損傷，我們實驗觀察75μmol/L H2O2對體外培養的RPE的增殖抑制作用及促進凋亡的作用，且這種作用具有時間依賴性。單純150ng/mL BMP-6可以呈時間依賴性地對RPE細胞有輕微的促增殖作用。添加BMP-6可以阻止H2O2對RPE細胞的氧化損傷。在作用3h和6h時，H2O2+BMP-6組與H2O2組相比較差異有統計學意義，可以看出，BMP-6早期是可以阻止H2O2對RPE細胞的氧化損傷。在隨后的細胞形態觀察中發現，作用3h和6h時，H2O2組細胞明顯皺縮及脫落，H2O2+BMP-6組細胞脫落及皺縮現象有所減少。在流式細胞儀檢查中發現，作用3h和6h時，H2O2+BMP-6組的凋亡率均較H2O2有所降低。在本實驗中發現，75μmol/L H2O2可以縮短G1期時相，加快細胞周期的進程。既往研究氧化應激對細胞周期的影響表明，根據細胞類型的不同、細胞培養條件的不同及氧化應激水平的不同，細胞周期的阻滯是多向的[15]：有的是阻滯于G1期，有的是G2期[16]。我們研究發現，H2O2可以促進細胞的凋亡，可以使細胞阻滯于G2+S期，而BMP-6可以逆轉這種阻滯。

綜上所述，體外培養的RPE細胞中，BMP-6對RPE細胞無明顯的毒性作用，可以輕微促進RPE細胞的增殖。BMP-6可以一定程度上保護視網膜色素上皮受到氧化應激的損傷，但是它的具體作用機制有待進一步的探討研究，本研究為探討治療AMD新方法奠定了一定的基礎。

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Li Chen1， Ming Liu2，Yong Liu3， De-Xiu Zhang1

Foundation item:Research and Development Program of Science and Technology of Shaanxi Province of China (No.2012K16-11-01)

1Department of Ophthalmology, the First Affiliated Hospital of Xi’an Jiaotong University, Xi’an 710061, Shaanxi Province, China;2Department of Ophthalmology, Xi’an No.1 Hospital, Xi’an 710001，Shaanxi Province, China;3Institute of Neurobiology, Xi’an Jiaotong University Health Science Center, Xi’an 710061, Shaanxi Province, China

Correspondence to:Yong Liu. Institute of Neurobiology, Xi’an Jiaotong University Health Science Center, Xi’an 710061, Shaanxi Province, China. liuy5599@mail.xjtu.edu.cn

Received：2015-07-04Accepted：2015-12-15

Abstract

?AIM:To investigate the effect of bone morphogenetic protein 6(BMP-6) on cellular morphology, proliferation and apoptosis of retinal pigment epithelial cells(ARPE-19) incubated in hydrogen peroxide(H2O2).

?METHODS:ARPE-19 cells were cultured conventionally and divided into four groups. One group was untreated as blank group, the other three groups were incubated in 75μm/L H2O2, 150ng/mLBMP-6 or75μm/L H2O2+150ng/mL BMP-6. All the groups were incubated for 3h, 6h, 9h and 12h. We tested the cell viabilitity by MTT. We used flow cytometry to test the cell cycle and cell apoptosis.

?RESULTS:H2O2significantly decreased the cell activity in time-dependent manner. The activity of cells with BMP-6+H2O2was higher H2O2group, and the differences between the two groups at 3h and 6h were significant (P<0.05). The observation on cellular morphology showed that the cell number decreased and the cell detachment after 6h incubated with H2O2， while the cells with BMP-6 were less cell detachment and apoptosis.

?CONCLUSION:BMP-6 has protective effects on RPE cells from oxidative stress in certain extent.

KEYWORDS:?bone morphogenetic protein 6;oxidative stress；age-related macular degeneration;hydrogen peroxide

DOI:10.3980/j.issn.1672-5123.2016.1.09

收稿日期：2015-07-04 修回日期： 2015-12-15

通訊作者：劉勇，博士，博士研究生導師，研究方向：腦血管病基礎研究與神經干細胞應用基礎研究.liuy5599@mail.xjtu.edu.cn

作者簡介：陳麗，女，在讀博士研究生，研究方向：視網膜疾病的基礎研究。

基金項目：中國陜西省科學技術研究發展計劃項目(No.2012K16-11-01)
作者單位：`1(710061)中國陜西省西安市，西安交通大學醫學院第一附屬醫院眼科；`2(710001)中國陜西省西安市第一醫院眼科；`3(710061)中國陜西省西安市，西安交通大學醫學院神經生物研究所