胰腺星狀細胞通過HGF/c-Met信號通路調控胰腺癌的侵襲轉移

崔英　沈曼茹　顏美珠　黃繼英　唐鄂　安敏　喻青　徐林芳　李曉翠　史先芳　高振軍

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胰腺星狀細胞通過HGF/c-Met信號通路調控胰腺癌的侵襲轉移

崔英沈曼茹顏美珠黃繼英唐鄂安敏喻青徐林芳李曉翠史先芳高振軍

目的探討胰腺星狀細胞(PSCs)調控胰腺癌的遷移和侵襲轉移機制。方法檢測PSCs培養上清液中肝細胞生長因子(HGF)蛋白的含量。應用PSCs上清液、PSCs上清液加HGF中和抗體或加c-Met特異性抑制劑PHA-665752分別處理人胰腺癌細胞株AsPC-1細胞，以不加PSCs上清液細胞作為對照組，采用MTT法檢測AsPC-1細胞的增殖，Transwell小室檢測細胞遷移能力，體外侵襲實驗觀察細胞侵襲能力。 結果PSCs上清液中HGF蛋白含量為(4 213±543)ng/L。PSCs上清液組、PSCs上清液+HGF中和抗體組、PSCs上清液+c-Met抑制劑組及對照組細胞增殖的A490值分別為0.628±0.030、0.324±0.021、0.347±0.054及0.405±0.008，穿膜細胞數分別為(123.3±6.8)、(62.4±6.9)、(58.1±2.2)、(36.6±4.8)/400倍視野，侵襲細胞數分別為(70.0±2.3)、(42.5±4.6)、(42.7±2.8)、(36.4±3.5)/400倍視野。PSCs上清液組細胞增殖、穿膜及侵襲能力較對照組顯著升高，PSCs上清液+HGF中和抗體組及PSCs上清液+c-Met抑制劑組細胞增殖、穿膜及侵襲能力較PSCs上清液組顯著下降，差異均有統計學意義(P值均<0.01)，而PSCs上清液+HGF中和抗體組與PSCs上清液+c-Met抑制劑組之間的細胞增殖、穿膜及侵襲能力差異無統計學意義(P值均>0.05)。結論PSCs可能是通過HGF/c-Met信號通路從而調控胰腺癌細胞的增殖、遷移和侵襲。

胰腺腫瘤；星形細胞；肝細胞生長因子；原癌基因蛋白質c-Met

近年來胰腺癌的發病率有增高的趨勢[1-2]。由于發展迅速，早期即有局部及遠處轉移，故胰腺癌預后極差。研究證實，胰腺星狀細胞(pancreatic stellate cells, PSCs)可促進胰腺癌的侵襲轉移[3-4]，但其機制尚不清楚。本課題組既往的研究證實，SDF-1/CXCR4受體配體系統在PSCs促進胰腺癌轉移侵襲中起重要作用，但抑制SDF-1/CXCR4途徑并不能完全抑制腫瘤的侵襲轉移，故可能存在其他調控機制。肝細胞生長因子(hepatocyte growth factor, HGF)/c-Met信號通路被認為與許多惡性腫瘤的發生、發展密切相關，其中包括胃癌、肺癌、食道癌、乳腺癌、肝癌、結腸癌、前列腺癌、腎癌、頭頸部癌、卵巢癌等[5-6]。本研究旨在進一步探討HGF/c-Met信號通路在胰腺癌侵襲轉移中的作用。

材料與方法

一、PSCs上清液的制備

胰腺癌根治術中獲取新鮮癌旁組織，在無菌環境、無血清培養液中剪成0.5 mm3大小的組織塊，貼放于培養皿中，間隔0.5～1.0 cm。加入含20%胎牛血清(FCS)的DMEM/F12培養液培養24 h后更換培養液培養3～5 d，每2～3 d更換培養液。待組織塊周圍有星狀細胞爬出并形成克隆后小心去除組織塊，用含乙二酰四乙酸(EDTA)的0.25%胰蛋白酶消化細胞，洗滌后置培養皿中培養。待細胞貼壁生長至70%～80%融合時按1∶3比例傳代。收集對數生長期PSCs，棄去培養液，用PBS沖洗2遍，加無血清DMEM/F12培養液5 ml培養48 h，收集上清液，過濾去除細胞碎片，置-80℃保存備用。

二、PSCs培養上清液HGF蛋白含量的檢測

采用ELISA法定量測定PSCs上清液HGF蛋白含量，人HGF ELISA試劑盒購自江蘇晶美生物科技有限公司，按說明書操作。上Bio-rad比色儀測定各孔在490 nm處的吸光度值(A490值)。參照標準曲線計算樣本濃度。HGF最小檢測濃度為40 ng/L。

三、人胰腺癌AsPC-1細胞增殖的檢測

人胰腺癌細胞株AsPC-1購自中科院細胞庫，常規培養、傳代。取對數生長期AsPC-1細胞制成單細胞懸液，按每孔5×103個細胞(100 μl)接種于96孔板,貼壁生長后換無血清培養液(SFM)。實驗分4組，分別為加入PSCs上清液、PSCs上清液+60μg/ml HGF中和抗體(Sigma-Aldrich公司)、PSCs上清液+100 nmol/L c-Met抑制劑PHA-665752(Selleck chemicals公司)的SFM，以單加SFM為對照組。每組設5個平行孔，培養24 h后每孔加入濃度為5 mg/ml的MTT 20 μl繼續培養4 h，吸棄上清液，每孔加入150 μl DMSO振蕩10 min，用酶標儀測定各孔在490 nm波長處的吸光度值(A490值)。

四、細胞遷移實驗

收集對數生長期AsPC-1細胞，應用SFM制備2×105/ml的單細胞懸液。取Transwell小室，在隔膜的上室鋪100 μl/ml的纖連蛋白(Fn，Sigma-Aldrich公司)50 μl，各組上室加入200 μl的細胞懸液，下室分別加入500 μl PSCs上清液、PSCs上清液+60 μg/ml HGF中和抗體、PSCs上清液+100 nmol/L PHA-665752的SFM,以只加SFM為對照組。每組5個Transwell小室。常規培養12 h，取出隔膜，用棉簽輕輕擦去未穿膜細胞，用0.1%結晶紫染色20 min，高倍鏡下隨機取10個視野，計數穿膜細胞數，取均值。實驗重復3次。

五、細胞侵襲實驗

收集對數生長期AsPC-1細胞，加入SFM制備1×106/ml的單細胞懸液。應用體外侵襲試劑盒ECM550(Chemicon公司)檢測細胞體外侵襲能力。各組上室加入300 μl細胞懸液，下室分別加入500 μl PSCs上清液、PSCs上清液+60μg/ml HGF中和抗體、PSCs上清液+100 nmol/L PHA-665752的含2% FCS培養液，以單加500 μl含2% FCS的培養液為對照組。每組5個小室。培養48 h后，用0.1%結晶紫染色20 min，高倍鏡下隨機計數10個視野的穿膜細胞數，取均數。實驗重復3次。

六、統計學處理

結　　果

一、PSCs上清液中HGF蛋白的含量

PSCs上清液中HGF蛋白的含量為(4 213±543)ng/L。

二、AsPC-1細胞增殖的變化

PSCs上清液組、PSCs上清液+HGF中和抗體組、PSCs上清液+c-Met抑制劑組及對照組培養24 h的細胞增殖A490值分別為0.628±0.030、0.324±0.021、0.347±0.054及0.405±0.008,PSCs上清液組較對照組顯著升高，PSCs上清液+HGF中和抗體組及PSCs上清液+c-Met抑制劑組較PSCs上清液組顯著下降，差異均有統計學意義(P值均<0.01)，PSCs上清液+HGF中和抗體組與PSCs上清液+c-Met抑制劑組間差異無統計學意義(P>0.05)。

三、AsPC-1細胞遷移能力變化

PSCs上清液組、PSCs上清液+HGF中和抗體組、PSCs上清液+c-Met抑制劑組及對照組的穿膜細胞數分別為(123.3±6.8)、(62.4±6.9)、(58.1±2.2)、(36.6±4.8)/400倍視野，PSCs上清液組較對照組顯著增加， PSCs上清液+HGF中和抗體組與PSCs上清液+c-Met抑制劑組較PSCs上清液組顯著減少，差異均有統計學意義(P值均<0.01)，而PSCs上清液+HGF中和抗體組與PSCs上清液+c-Met抑制劑組間的差異無統計學意義(P>0.05)。

四、AsPC-1細胞體外侵襲能力變化

PSCs上清液組、PSCs上清液+HGF中和抗體組、PSCs上清液+c-Met抑制劑組及對照組的侵襲細胞數分別為(70.0±2.3)、(42.5±4.6)、(42.7±2.8)、(36.4±3.5)/400倍視野，PSCs上清液組較對照組顯著增多，PSCs上清液+HGF中和抗體組及PSCs上清液+c-Met抑制劑組較PSCs上清液組顯著減少，差異均有統計學意義(P值均<0.01),而PSCs上清液+HGF中和抗體組與PSCs上清液+c-Met抑制劑組間的差異無統計學意義(P>0.05)。

討　　論

胰腺癌組織中有大量間質組織，腫瘤-間質之間的相互作用在腫瘤進展中起著重要作用。1998年Bachem等[7]確定胰腺組織中胞質含維生素A的細胞為PSCs，該細胞位于胰腺小葉間和腺泡周圍區，圍繞鄰近腺細胞基底部，在正常胰腺組織中處于靜止狀態，活化時胞質內脂滴消失、呈α-SMA染色陽性的肌成纖維樣細胞。胰腺癌在病理組織學上大部分以腫瘤周圍纖維化增加為特點，且纖維化程度與腫瘤的侵襲轉移程度相關。大量實驗證實促進胰腺纖維化的細胞為PSCs[8-9]。但PSCs促進胰腺癌侵襲轉移的機制尚未完全清楚。本課題組既往的實驗證實，使用PSCs上清液處理AsPC-1細胞后可以促進其增殖、遷移和侵襲，應用SDF-1抗體中和后該促進作用被抑制，提示PSCs分泌到培養上清中的SDF-1促進胰腺癌細胞增殖、遷移和侵襲。但也發現可能存在其他一些因子影響癌細胞的增殖、轉移及侵襲[10]。

肝細胞生長因子主要來源于基質成纖維細胞[11]，是一種多功能的細胞因子，具有強大的促分裂、組織成形、誘導上皮細胞遷移、侵襲以及誘發血管生成的作用[12]，其生物學活性由c-Met受體蛋白介導。當HGF與其受體c-Met結合后，胞質中的酪氨酸殘基可發生磷酸化，進而激活c-Met蛋白激酶結構域中的酪氨酸激酶(PTK),活化的PTK可引起c-Met羧基末端酪氨酸的磷酸化[13]。HGF/c-Met介導的信號轉導通路可使細胞-細胞間的黏附作用減弱，增強整合素的功能活性，促進細胞與細胞外基質成分的黏附，從而刺激多種類型癌細胞的遷移、侵襲[14]。

本研究結果顯示，應用含有HGF的PSCs上清液處理AsPC-1細胞后可促進細胞增殖、遷移及侵襲；應用HGF中和抗體后PSCs上清液對腫瘤細胞增殖、遷移和侵襲作用被抑制；應用c-Met抑制劑處理PSCs上清液后AsPC-1細胞增殖、遷移和侵襲作用也被明顯抑制，表明HGF可能通過HGF/c-Met信號通路調控胰腺癌的增殖、侵襲及轉移，該通路是除了SDF-1/CXCR4受體配體系統外另一個與胰腺癌的惡性生物學行為密切相關的信號通路。

[1]Maisonneuve P，Lowenfels AB. Epidemiology of pancreatic cancer:an update[J].Dig Dis, 2010,28(4-5):645-656. DOI: 10.1159/000320068. Epub 2010 Nov 18.

[2]Yadav D, Lowenfels AB. The epidemiology of pancreatitis and pancreatic cancer[J].Gastroenterology,2013,144(6):1252-1261. DOI: 10.1053/j.gastro.2013.01.068.

[3]Hwang RF,Moore T,Arumugam T,et al.Cancer-associated stromal fibroblasts promote pancreatic tumor progression[J].Cancer Res,2008,68(3):918-926. DOI 10.1158/0008-5472.CAN-07-5714.

[4]Bachem MG,Zhou S,Buck K,et al.Pancreatic stellate cells-role in pancreas cancer[J].Langenbecks Arch Surg,2008,393(6):891-900. DOI: 10.1007/s00423-008-0279-5.

[5]Eder JP,Vande Woude GF,Borner SA,et al.Noval therapeutic inhibitors of the c-Met signaling pathway in cancer[J].Clin Cancer Res,2009,15(7):2207-2214. DOI: 10.1158/1078-0432.CCR-08-1306. Epub 2009 Mar 24.

[6]Gayyed MT, Abd El-Maqsoud NM, El-Hameed El-Heeny AA, et al. c-MET expression in colorectal adenomas and primary carcinomas with its corresponding metastases[J].J Gastrointest Oncol,2015,6(6):618-627. DOI: 10.3978/j.issn.2078-6891.2015.072.

[7]Bachem MG, Schneider E, Gross H, et al. Identification, culture, and characterization of pancreatic stellate cells in rats and humans[J]. Gastroenterology,1998, 115(2): 421-432.

[8]Bachem MG, Schunemann M, Ramadani M, et al. Pancreatic carcinoma cells induce fibrosis by stimulating proliferation and matrix synthesis of stellate cells[J]. Gastroenterology,2005, 128(4): 907-921.

[9]Apte M,Pirola RC,Wilson JS. Pancreatic stellate cell: physiologic role, role in fibrosis and cancer[J].Curr Opin Gastroenterol,2015,31(5):416-423. DOIi: 10.1097/MOG.0000000000000196.

[10]高振軍，吳愷，王興鵬.胰腺星狀細胞對胰腺癌AsPC-1細胞侵襲轉移的影響[J].中華胰腺病雜志,2013,13(4):244-247. DOI:10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2013.04.009.

[11]Yen BL,Yen ML,Hsu PJ,et al. Multipotent human mesenchymal stromal cells mediate expansion of myeloid-derived suppressor cells via hepatocyte growth factor/c-Met and STAT3[J].Stem Cell Reports,2013,1(2):139-151. DOI: 10.1016/j.stemcr.2013.06.006. eCollection 2013.

[12]Nakamura T,Mizuno S. The discovery of hepatocyte growth factor(HGF) and its significance for cell biology,life sciences and clinical medicine[J].Proc Jpn Acad Ser B Phys Biol Sci,2010,86(6):588-610.

[13]Gelsomino F,Rossi G,Tiseo M.MET and small-cell lung cancer[J].Cancers(Basel),2014,6(4):2100-2115. DOI: 10.3390/cancers6042100.

[14]Matsumura A,Kubota T,Taiyoh H,et al. HGF regulates VEGF expression via the c-Met receptor downstream pathways,PI3K/Akt,MAPK and STAT3, in CT26 murine cells[J]. Int J Oncol,2013,42(2):535-542. DOI: 10.3892/ijo.2012.1728.

(本文編輯：呂芳萍)

The regulation of invasion and metastasis of human pancreatic cancer by pancreatic stellate cells via the HGF/c-Met pathway

CuiYing,ShenManru,YanMeizhu,HuangJiying,TangE,AnMin,YuQing,XuLinfang,LiXiaocui,ShiXianfang,GaoZhenjun.

DepartmentofGastroenterology,ZhongshanHospitalQingpuBrach,FudanUniversity,Shanghai201700,China

Correspondingauthor:GaoZhenjun,Email：cui_yin@126.com

ObjectiveTo investigate the regulation mechanism of pancreatic stellate cells (PSCs) on invasion and metastasis of human pancreatic cancer through the pathway of HGF/c-Met. MethodsHepatocyte growth factor (HGF) level in PSCs supernatant was detected. PSCs supernatant, PSCs supernatant plus anti-HGF antibody, PSCs supernatant plus c-Met specific inhibitor PHA 665752 were used to treat human pancreatic cancer AsPC-1 cells, and untreated cells served as controls. MTT assay was applied to detect cell proliferation. Transwell chamber migration assay was employed to detect cell migration. In vitro invasion assay was used to determine cell invasion. ResultsThe level of HGF in PSCs supernatant was (4 213±543)ng/L.A490value for cell proliferation in PSCs supernatant, PSCs supernatant+anti-HGF, PSCs supernatant+c-Met inhibitor and control group were 0.628±0.030, 0.324±0.021, 0.347±0.054 and 0.405±0.008. The number of penetrating cells per 400 high power field was 123.3±6.8, 62.4±6.9, 58.1±2.2 and 36.6±4.8, respectively. The number of invasive cells per 400 high power field was 70.0±2.3, 42.5±4.6, 42.7±2.8 and 36.4±3.5. The proliferation, migration and invasion of pancreatic cancer AsPC-1 cells in PSCs supernatant group were significantly higher than those in the control group(allP<0.01). The proliferation, migration and invasion of pancreatic cancer AsPC-1 cells in PSCs supernatant+anti-HGF and PSCs supernatant+c-Met inhibitor group were significantly lower than those in PSCs supernatant group(P<0.01), but there was no difference between the PSCs supernatant+anti-HGF group and PSCs supernatant+c-Met inhibitor group(allP>0.05). ConclusionsPSCs can promote cell proliferation, migration and invasion of pancreatic cancer AsPC-1 cells via regulating HGF/c-Met pathway.

Pancreatic neoplasms;Astrocytes;Hepatocyte growth factor;Proto-oncogene proteins c-Met

10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2016.04.005

201700上海，復旦大學附屬中山醫院青浦分院消化科

高振軍，Email：cui_yin@126.com

2016-01-06)