膠質瘤預后相關分子標志物的研究進展

張洪欣，馬瑞敏，張國軍，康熙雄

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膠質瘤預后相關分子標志物的研究進展

張洪欣，馬瑞敏，張國軍，康熙雄

作者單位：100050 北京，首都醫科大學附屬北京天壇醫院/北京市免疫試劑臨床工程技術研究中心

神經膠質瘤，是原發于中樞神經系統的一類最常見的腫瘤。盡管在過去的幾十年中，神經膠質瘤的治療已有很大進展，但是大多數患者的臨床結局仍然很差，尤其是膠質母細胞瘤（GBM），中位生存期只有 14.6 個月，經過及時、有效的治療，只有 5% ～ 10% 的患者生存期可以達到兩年[1]。

近年來，手術聯合放療和替硝唑胺化療已經成為膠質母細胞瘤的標準治療方案[2]，但是即使接受相同的治療，患者的生存期也明顯不同。生存期受很多因素影響，包括治療策略、患者的身體狀態、腫瘤的特征等。和這些因素相關的標志物往往是膠質瘤患者預后評價的關鍵，針對相關標志物的靶向治療將成為未來膠質瘤治療方面的重大突破，并對患者的生存期和生活質量產生重大影響，現就其在膠質瘤中的表達對預后的影響作一綜述。

1　受體酪氨酸激酶及 ppENK、MGMT 啟動子甲基化

1.1EphA2 及 ephrinA1

受體酪氨酸激酶（RTKs）作為跨膜細胞表面受體超家族，可通過調節第二信使的產生和基因轉錄，調控細胞增殖和存活。肝細胞性促紅細胞生成素（Eph）作為 RTKs 中最大的一個亞群，包括至少 16 個成員，調節細胞間相互作用、細胞遷移、中樞神經系統發育、腫瘤血管生成等過程。由于結構和配體選擇的不同，分為 A 和 B 亞型。EphA2 是EphA 的主要成員，epha 基因最早由 HeLa cDNA 文庫克隆而成，定位于染色體 1p36.1[3]，有研究證實，EphA2 在成年上皮細胞中低度表達，負責調控細胞增殖和遷移。相比之下，EphA2 在上皮起源的惡性腫瘤高度表達，可能參與腫瘤細胞的增殖、侵襲和凋亡。EphrinA1 作為 EphA2 的主要配體，可能通過調控 EphA2 的表達誘導腫瘤惡性表型改變。有研究發現，Eph 受體/ephrin（配體）系統的下調與腫瘤的形成、生長、轉移以及血管的生成密切相關[4]。值得注意的是，EphA2 受體在許多上皮惡性腫瘤和 hGBMs 中過度表達[5]。

Liu 等[6]提出 EphrinA1 的表達可能通過降低 EphA2的表達和下調 FAK 而削弱人腦膠質瘤 U251 細胞的增殖、遷移、黏附、生長。雖然許多研究表明在許多腫瘤中EphA2 高表達，而 EphrinA1 低表達，提示 EphA2 是EphrinA1 的負調節劑，但證據尚不足[7]。Li 等[8]的研究發現，在 GBM 細胞中 EphA2 的敲除會抑制 EphrinA1 的表達。

最近的研究已經證實 hGBM 細胞亞群的存在，它具有干細胞特性和腫瘤的形成及蔓延能力，被稱為腫瘤蔓延細胞（TPCs）[9]。Binda 等[10]對 12 個 hGBM 樣本進行分析，發現 EphA2 表達相對于其他 EphA 和 EphB 受體明顯升高，實時 PCR 顯示，EphA2 mRNA 水平在 hGBM 中相比于正常人腦組織明顯增高，證明了在 hGBM 中，TPCs 過度表達 EphA2，用于支持其未分化狀態，維持其自我更新的致瘤性，EphA2 促進 TPCs 的干細胞潛力和腫瘤傳播能力。持續的顱內 EphrinA1-Fc 的輸注以及 siRNA 介導的EphA2 的敲除都會導致 TPCs 自我更新的喪失和誘導分化。基于以上研究，在惡性膠質瘤中 EphA2 和 EphrinA1表達之間存在雙向調制，因此可將 EphA2 和 EphrinA1 共同用于評估膠質瘤患者的預后。

1.2ppENK 啟動子的甲基化

前腦啡肽原（preproenkephalin，ppENK）位于染色體8q23-24，其編碼的 met-enkephalin 是一種阿片樣生長因子的前體，又是一種抑制因子，能夠抑制腫瘤生長、細胞更新、生長發育、傷口愈合和血管生成。其產物阿片類生長因子通過與阿片類生長因子受體結合發揮作用，能夠在體內和體外條件下抑制腫瘤生長[11-12]。目前主要在胰腺腺癌、胰管內乳頭狀黏液瘤和胰腺導管上皮腫瘤中發現了 ppENK 的甲基化失活[13]。

采用巢式聚合酶鏈反應（nPCR）和亞硫酸氫鹽修飾后測序法（BSP）檢測膠質瘤組織和正常腦組織中 ppENK 基因啟動子區 CpG 島的甲基化狀態，結果表明，ppENK 基因啟動子區 CpG 島的異常甲基化在膠質瘤組織中具有腫瘤特異性，與膠質瘤病理分級有關，是膠質瘤發生、發展過程中的中晚期事件。目前已經有研究發現 p16、hMLH1、SLCSA8 等相關基因啟動子區域 CpG 島的異常甲基化與腦膠質瘤病理分級密切相關，其甲基化率隨著腦膠質瘤惡性程度增加而增高，ppENK 甲基化率在不同級別腦膠質瘤中同樣存在這一變化趨勢，ppENK 基因啟動子區域 CpG 島的甲基化有可能成為腦膠質瘤評價惡性程度和預后的生物學標記[14]。

1.3MGMT 啟動子甲基化

烷化劑作為一種常見的化療藥，主要通過給腫瘤細胞DNA 加入毒性的加合物，導致 DNA 交聯，DNA 不能復制，致使腫瘤細胞死亡，膠質瘤的分子標記物 DNA 修復蛋白 O6-甲基鳥嘌呤-DNA 甲基轉移酶（MGMT）是研究廣泛的化學耐藥的機制之一。MGMT 基因啟動子甲基化是近年研究較多的膠質瘤相關分子標記物，除了對烷化劑化療敏感性的預測價值外，它們在膠質瘤中的預后價值已經得到肯定。具體作用機制如下：以直接損傷逆轉路徑，只需一步反應就能將 O6-AG 上的烷化基團共價轉移到自身的半胱氨酸活性位點上，使 DNA 上損傷的鳥嘌呤復原，甲基化的MGMT 蛋白失去活性，隨后從 DNA 上釋放下來，通過泛素化路徑降解，而不能重新脫甲基化以恢復活性[15]。

MGMT 基因啟動子甲基化可以直接影響 MGMT 蛋白的表達，MGMT 啟動子甲基化多發生于基因啟動子的CpG 島，也是 MGMT 基因最常見的改變。MGMT 啟動子甲基化已經在很多惡性腫瘤中發生，如肺癌、食管癌、乳腺癌、結腸癌、宮頸癌[16]等。在既往的腦膠質瘤研究中發現，膠質瘤患者的 MGMT 基因啟動子甲基化程度越高，患者的化療效果越差，患者的生存時間也越短，說明 MGMT 對于膠質瘤患者的預后和生存期有明顯的預測作用。

1.4端粒酶逆轉錄酶基因啟動子突變

端粒酶逆轉錄酶（TERE）基因位于染色體 5p15.33，長 40 kb，啟動子區長 11.2 kb，起始點上游是轉錄核心區域，啟動子突變后形成特殊序列，含有 ETS 轉錄調節因子結合位點，促使 TERT 表達的上調，激活端粒酶，維持端粒長度、結構，保護染色體的完整性，實現腫瘤的不斷增殖。

Killela 等[17]發現該突變主要發生在原發性膠質母細胞瘤和少突膠質細胞瘤中。進一步研究發現，突變位點在C228T 和 C250T，該位點不存在核苷酸多態現象。何潔等[18]通過研究發現，突變型患者的術后生存時間明顯短于野生型，在低級別組和高級別組中均與不良預后相關，表明對TRET 啟動子突變進行及時干預對于患者臨床轉歸及預后的重要性。

1.5異檸檬酸脫氫酶突變

異檸檬酸脫氫酶（IDH）有三種同工酶，IDH1和 IDH2被證明與腫瘤相關，研究較為成熟的是 IDH1。IDH1 位于2q33.3，全長 18 841 bp，基因突變主要發生于外顯子 4 上第 132 個氨基酸位點[19]，該處為 IDH1 的活性位點，突變導致其活性的降低，降低代謝產物，從而抑制腫瘤細胞的大量增殖。

研究發現，IDH 基因突變主要發生于高級別膠質母細胞瘤中[20]。IDH1 基因突變是膠質瘤患者預后的關鍵因素，突變型患者較野生型對化療藥物更敏感，患者的生存期明顯延長。

1.61p/19q 共缺失

1 號染色體短臂（1p）和 19 號染色體長臂（19q）共缺失是少突膠質細胞瘤的分子指標，有研究發現 1p/19q 缺失的少突膠質細胞對化療敏感且中位生存期較未缺失者明顯延長。

孫浩和李衛[21]通過熒光雜交檢測 1p/19q 缺失情況，同時通過免疫組化檢測 Ki-67（一種細胞增殖核抗原，定位于10 號染色體）的表達，發現兩者顯著相關，在Ki-67 高表達的細胞中，很少發生 1p/19q 的共缺失，兩者可以共同檢測指導患者的不良預后。

Eckel-Passow 等[22]根據 TERT 啟動子突變、IDH 突變、1p/19q共缺失三項指標將膠質瘤患者分為 5 組進行分析，發現單純 TERT 突變患者的生存期明顯短于其他患者，三重陰性組的患者總體生存期明顯短于 TERT 和 IDH 雙重突變組或三重陽性組，在 IV 級膠質瘤中，單因素分析顯示三項指標不同組合與總體生存期相關，但是多因素分析未發現獨立相關性，從而證明分子病理指標在對臨床預后判斷的重要性。

2　新近發現的臨床更易檢測的分子標記物

2.1血清白蛋白

血清白蛋白由肝臟合成，是血清中主要的蛋白質成分，在維持血漿膠體滲透壓、物質代謝、營養等方面發揮重要作用。作為患者營養狀況指標之一，術前血清白蛋白水平與膠質瘤患者的生存期相關，患者的白蛋白水平偏高，往往能耐受放、化療等標準輔助治療方案，不會發生低蛋白血癥，總的生存期延長。盡管白蛋白與前蛋白、總蛋白水平和淋巴細胞計數相關，并協同反映患者的營養狀況，但多因素分析發現，血清白蛋白對于患者的預后評價更有幫助，考慮與其參與炎癥反應相關。之前有研究表明，胰島素樣生長因子結合蛋白-2（IGFBP-2）與膠質瘤患者的生存期呈負相關[23]，具體機制是由于血腦屏障破壞，外源性 IGFBP-2 在腦內高濃度聚集，通過整合素 β1-ERK 途徑刺激膠質瘤細胞增殖、侵襲和對替硝唑胺的耐受[24]。最新研究發現，在許多病理生理過程中，低血白蛋白與高 IGFBP-2 明顯相關[25]，高IGFBP-2 加速 IL-6（通常增加分解代謝，抑制肝臟合成）的生成，使患者的營養狀況變差。因此，白蛋白、IGFBP-2、IL-6 之間的相互作用明顯影響患者的臨床結局，從而導致患者的預后不良。

2.2上皮水解素

上皮水解素（MMP-28）是最新發現的基質金屬蛋白酶（MMPs）成員，克隆自人的角化上皮和睪丸的 cDNA 文庫[26]，在正常組織如睪丸、肺、心臟和胃腸道中表達，但相應組織中的具體細胞尚不明確[27]。有研究表明，它能誘導 TGF-β 參與的上皮間質轉化和細胞侵襲過程[28]，而細胞內外研究證實，TGF-β 介導的上皮間質轉化參與惡性膠質瘤 GBM 的進展[29]，因此，MMP-28 可能參與膠質瘤的進展。Wang 等[30]采用免疫組化染色技術測定不同組織中MMP-28 蛋白的表達，膠質瘤組織中的表達明顯高于正常組織，推測 MMP-28 具有致瘤作用。采用單、多變量分析發現，MMP-28 的表達是膠質瘤患者總生存期的獨立危險因素，與患者的年齡、KPS 評分、切除范圍、MGMT 啟動子甲基化、IDH1/2 突變共同參與惡性膠質瘤患者的預后評價和臨床結局。

2.3組蛋白脫乙酰基酶類

染色體不穩定性（CIN）是癌癥的特點，與腫瘤的發生密切相關。作為基因組不穩定的一個主要形式，CIN 在腫瘤形成的早期階段起關鍵作用，當各種形式復合存在時，會導致正常細胞轉化為癌細胞[31]。CIN 各種形式在癌癥中已有發現，包括突變、雜合性的缺失、拷貝數量的改變等。CIN 可影響化療的敏感性，從而影響患者的預后[32]。

組蛋白脫乙酰基酶類（HDACs）調控染色體結構，與癌癥細胞中染色體完整性的丟失相關。HDACs 是組蛋白乙酰化的主要調控者，有研究表明，CIN 和組蛋白乙酰化之間明顯相關，組蛋白乙酰化的核心是 HDACs，它通過靶向組蛋白和非組蛋白，來維持基因組的完整性，由此調控DNA 的修復機制[27]。18 組人類 HDACs 被劃分為四類，作為 II 型 HDACs 之一，HDAC4 和許多疾病過程密切相關，包括癌癥、白血病、糖尿病、感染和心臟病，它在腦中也高度表達，參與腦部各種功能，包括學習和記憶、行為、神經元的長久存活等[33]。

一些研究已經證實 HDAC4 在癌細胞中的各種角色。在軟骨肉瘤中，HDAC4 表達水平的下降會導致血管內皮生長因子表達的上調，從而刺激血管的生成[34]。在前列腺癌細胞中，HDAC4 的下調和高水平雄激素受體（促進細胞增殖）的表達相關[35]。Cheng 等[36]選取 529 例膠質瘤患者分組進行研究，發現 HDAC4 的表達在不同級別膠質瘤中表達不同，級別越高，表達越低。同樣級別越高，CIN 的評分越高。通過進行基因集富集分析（GSEA）發現，HDAC4的表達在功能上與染色體結構的維持密切相關。綜合提示CIN 通過 HDAC4 反映基因表達與膠質瘤的密切關系。根據 HDAC4 表達水平進行分組，生存分析顯示 HDAC4 的過度表達意味著總生存期的延長和疾病進展的延遲。

幾項研究已經表明，MGMT 啟動子甲基化所致MGMT 的缺失可提高烷化劑的敏感度，但是一些膠質瘤患者 MGMT 啟動子甲基化仍然表現對這些藥物的耐受性，因此，評估基因組完整性聯合 MGMT 啟動子甲基化可以對耐藥機制有更深的理解。MGMT 啟動子甲基化的 GBM 患者接受放化療聯合分析顯示 CIN 評分低，患者的生存期延長，而 CIN 評分高的組分患者的臨床結局往往較差。這些結果表明，MGMT 啟動子甲基化導致的對化療的敏感性依賴于穩定基因組的存在，根據基因的不穩定程度可將MGMT 啟動子甲基化的患者進行明確分級。基于上述HDAC4 表達與 CIN 之間的緊密相關，MGMT 啟動子甲基化聯合 HDACA 的表達用于評估患者的臨床結局。有趣的是，對于高度惡性的 GBM，MGMT 啟動子甲基化、HDAC4 高表達（暗示低級別 CIN）聯合放療能最大程度地受益。因此，綜合兩者可以確保患者預后良好以及獲得最有效的治療效果[37]。

2.4Smad4

Smad 蛋白參與轉化生長因子-β（TGF-β）超家族信號從細胞表面到細胞核的轉移。Smad4 是 Smad 蛋白家族中第二類通用調節 Smad，它最初在胰腺導管腺癌中發現作為腫瘤抑制基因定位于 18q21.1 染色體上，是 TGF-β-Smad信號通路的主要調解者，抑制上皮細胞的增殖[38]。細胞內外研究已經發現，定位于 18q21 染色體的 Smad4 基因的突變在腫瘤生成和胰腺癌、前列腺癌、大腸癌等實體瘤的進展中起關鍵作用。

Zurawel 等[39]在神經膠質瘤 DNA 樣本中進行調查，在髓質母細胞瘤中沒有發現 Smad4 基因的突變。Yang 等[40]通過將重組腺病毒編碼 Smad4 基因轉入 U251 細胞株上，采用蛋白質印跡技術監測細胞的增殖及凋亡情況，結果顯示，Smad4 基因的過度表達增加 G0/G1 期細胞的比例，并能下調細胞周期蛋白 D1 和上調 P27 的表達，將細胞周期阻滯在 G1 期，抑制細胞增殖。另外，Smad4 的過度表達促進膠質瘤細胞的凋亡，總之，Smad4 基因在膠質瘤細胞中具有抑制增殖的能力，可以作為未來膠質瘤治療的一個新的靶點，明確改善患者的預后和增加患者的生存期。

3　microRNA 中與膠質瘤預后相關標志物

3.1miR-210

miR-210 的莖環結構序列位于由 11p15.5 染色體上AK123483基因轉錄生成的非編碼 RNA 的內含子內，隨著miRNA 研究的不斷進展，miR-210 是目前一致公認的在乏氧的正常或腫瘤細胞中表達變化最顯著的 miRNA，在生理狀態下及惡性腫瘤環境中對乏氧細胞的增殖、凋亡、血管生成、DNA 損傷修復和能量代謝起重要作用[41]。miR-210 在腫瘤中的表達通常是升高的，例如黑色素瘤、腎透明細胞癌、胰腺癌[42]和乳腺癌[43]。Lai 等[44]通過采用實時定量 PCR 等技術證實膠質瘤腫瘤微環境的主要特點是缺氧，乏氧誘導因子（HIF-1）是低氧誘導結合蛋白，是由 1 個對氧分壓敏感的 α 亞基（HIF-1α）和一個組成性的 β 亞基（HIF-1β）構成的異二聚體，可調控細胞周期進程相關基因的表達。HIF-1發揮作用主要由 HIF-1α 亞基的表達和活性決定的，miR-210 受 HIF-1α 的調控，HIF-1α 在接近 miR-210 啟動子處直接與轉錄起始點上游大約 40 bp 的乏氧反應元件（hypoxia responsive element，HRE）結合。作為 HIF-1α 靶基因的 miR-210 能夠提高間充質干細胞（MSCs）在缺血、缺氧和再氧合預處理時的生存能力。缺氧是抑制干細胞分化的重要環境因子，miR-210 在細胞缺氧條件下可通過抑制誘導性多能性干細胞（iPS）死亡來加強體細胞基因重排。鑒于 miR-210 的表達與乏氧的密切關系，血液循環中miR-210 水平有可能成為膠質瘤患者的預后指標。另外，在膠質瘤中，miR-210 的過度表達與低功能狀態（KPS）評分、高病理級別，無疾病進展時間（PFS）和總生存期（OS）縮短相一致，適于術后預后的分析評價。

3.2miR-200b

miR-200b 定位于染色體 1p36，可以調節轉錄因子 Zeb-1 和Ets-1，以及 Suz12（一種轉錄抑制因子復合物的亞基）。最近的研究表明，miR-200b 在大部分癌癥中起抑制作用，如胃癌、胰腺癌、大腸癌、乳腺癌和子宮內膜癌等[45]。miR-200b 可調控上皮間質轉化、化療敏感性和細胞的增殖。有研究表明，miR-200b 的下調伴隨著 EMT 的誘導者Zeb-1 和 Zeb-2 的上調，與癌細胞的間質和藥物抵抗表型高度相關[46]。在膠質瘤中，miR-200b 靶向 CREB1 基因，抑制體內腫瘤細胞的生長。

Men 等[47]采用實時定量 PCR 對膠質瘤患者和正常組織 miR-200b 的表達進行檢測，顯示膠質瘤組織中miR-200b的表達較正常組織下調，而且下調的程度依賴于膠質瘤的病理級別，級別越高、KPS 評分越低，miR-200b 的表達越低。生存分析顯示，miR-200b 的異常表達與低級別的膠質瘤（I 級和 II 級）患者的預后無明顯相關，可能與低級別的膠質瘤復發率和死亡率較低有關，因此在高級別膠質瘤（III 級和 IV 級）中評價 miR-200b 的預后價值更有意義。更重要的是，當依據 miR-200b 對惡性膠質瘤進行分層時，miR-200b 表達低的患者的無進展生存期和總生存期明顯縮短，提示 miR-200b 是監測膠質瘤患者預后的獨立因素。

3.3miR-33a

miR-33a 基因位于甾醇調控元件結合蛋白（SREBP）基因的內含子區，具有調控膽固醇及脂肪酸代謝作用。Cirera-Salinas 等[48]的研究發現，過表達 miR-33a 可抑制CDK6 和 cyclinDl mRNA 的表達，抑制細胞增殖。使細胞周期抑制在 G1 期。Fuster 和Andrés[49]報道 miR-33 可結合 P53 mRNA 的 3'UTR 區，抑制 P53 基因表達，在造血干細胞中可觀察到細胞高表達 miR-33，抑制P53水平，并影響造血干細胞的自我更新能力。

膠質母細胞瘤是惡性程度最高的原發性腦腫瘤，大多數生存期不到一年，其組織內表現明顯的異質性，包含一個細胞亞群即腫瘤起始細胞（TIC）又稱癌癥干細胞或膠質瘤起始細胞（GICs）[50]，具有明顯的致瘤作用，能自我更新，能誘導 CD133、轉錄因子巢蛋白和少突膠質細胞轉錄因子-2（OLIG2）的表達，能分化為多種譜系，如神經元、星形膠質細胞和少突膠質細胞[51]。有研究證實，GICs 能抗放、化療，從而介導膠質瘤的不斷復發[52-53]。

Wang 等[54]證實了 miR-33a 在膠質瘤中對腫瘤干細胞的作用，即促進干細胞的增殖和自我更新，具體機制如下：CD133 是公認的腦腫瘤干細胞標志物，在高級別星形膠質細胞瘤的大量肥胖細胞中陽性表達顯著，而含肥胖細胞成分的膠質瘤預后不良。GICs 具有干細胞特性，CD133 陽性表達，miR-33a 維持 GICs 的生長和自我更新。miR-33a 的過度表達促進 CD133 陰性的非膠質瘤起始細胞（non-GICs）表現干細胞的特性，同時促進神經球的形成和干細胞標志物（nestin、OLIG2、BMI1）表達的增加和顱內腫瘤的形成。GICs 生物特性的維持需要 miR-33a，miR-33a 主要是通過調控 PKA 和 Notch 信號通路得以實現。

在 PKA 通路中，miR-33a 通過抑制它的直接靶點PDE8A 促進CD133 陽性的 GICs 的自我更新，從而增強PKA 通路的活動。而在 Notch 信號通路中，在 CD133 陽性的 GICs 中，miR-33a 表達下降，miR-33a 通過抑制它的直接靶點 UVRAG 促進 CD133 陽性的 GICs 的自我更新。miR-33a 介導的信號通路對于膠質瘤的進展是至關重要的，靶向細胞信號網絡可以是未來 GBM 治療的趨勢，對于膠質瘤的預后評估也具有重要的意義。

4　結語

隨著研究的不斷深入，膠質瘤的診斷和治療不僅僅局限于傳統的學術指南，越來越多的研究傾向于基因和分子靶向治療，通過特異性作用于發病的特定階段，遏制疾病的進展，從而延長患者壽命并提高患者生存質量是膠質瘤患者預后的終極目標，然而膠質瘤的惡性程度及患者發病的異質性，決定了膠質瘤患者的預后不良。因此，尋找特異性的分子標記物，采取特異及個體化的治療方案，成為未來膠質瘤研究的主導方向，并對膠質瘤患者預后的改善具有顯著影響。

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收稿日期：2015-10-28

通信作者：康熙雄，Email：kangxx@vip.sina.com

基金項目：北京市自然科學基金（7154193）

DOI:10.3969/j.issn.1673-713X.2016.01.012