江蘇地區漢族人群血小板CD36抗原缺失型表型的分析

陳青，段志敏，蔡莉，陳蓉，肖建宇，黃成垠，莊云龍

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江蘇地區漢族人群血小板CD36抗原缺失型表型的分析

陳青，段志敏，蔡莉，陳蓉，肖建宇，黃成垠，莊云龍

【摘要】

目的探索江蘇地區漢族人群血小板表面 CD36 抗原缺失型表型的多態性。

方法應用流式細胞技術檢測江蘇地區 140 位獻血者血小板表面 CD36 抗原的表達，以及對血小板表面 CD36 抗原缺失的標本，進一步檢測其單核細胞表面 CD36 的表達。結果140 名獻血者中，血小板表面 CD36 抗原表達缺失的有 4 例，缺失型頻率為 2.86%，其中 I 型缺失占 0.71% （1/140），II 型缺失占 2.14%（3/140）。

結論江蘇地區漢族人群中，CD36 抗原表型具有多態性，血小板表面 CD36 抗原缺失型個體的頻率略低于亞洲其他國家人群；其中 CD36 抗原 II 型缺失比例高于 I 型缺失。【關鍵詞】 抗原，CD36；血小板輸注；流式細胞術

www.cmbp.net.cn中國醫藥生物技術, 2016, 11(1):38-41

作者單位：210042 南京，江蘇省血液中心（陳青、蔡莉、陳蓉、肖建宇、黃成垠）；210042 南京，中國醫學科學院北京協和醫學院皮膚病研究所（段志敏）；250014 濟南，山東省血液中心（莊云龍）

血小板輸注治療是現代輸血醫學的重要內容之一。CD36 又稱血小板膜糖蛋白 IV（GP1V）、Naka、GPIIIb 等，是一種表達于血小板和單核細胞等細胞表面的單鏈糖蛋白，在血小板聚集、抗血管生成、腫瘤免疫等方面有重要作用[1]。研究發現，個體血小板表面 CD36 抗原缺乏可受免疫刺激產生抗-CD36，已證實抗-CD36 是血小板輸注無效的原因之一[2-3]，因而對獻血者 CD36 抗原表達檢測日益受到重視。CD36 抗原缺失的頻率在世界不同地區、種族和人群中有所不同。據報道，撒哈拉的非洲人、日本人、非洲裔美國人和白種人人群 CD36抗原缺失型頻率分別為 8%、3% ～ 11%、2.4% 和0.3%[1, 4-7]；國內廣州漢族人群 CD36 抗原缺失型頻率為 2.81%[8]；而廣西地區漢族、壯族、瑤族人群 CD36 抗原缺失型頻率分別為 3.59%、5.76% 和 2.38%[9-10]，提示 CD36 抗原缺失型頻率不僅存在人種區別，還存在地域和民族的差異。本研究應用流式細胞術對江蘇地區漢族人群獻血者血小板表面的 CD36 抗原表達進行檢測，并對 CD36 抗原缺失型獻血者進一步分析其單核細胞 CD36 表達情況。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1標本來源隨機抽取 2015 年 3 月來江蘇省血液中心無償捐獻血小板的獻血者 140 人，其中男 131 例，女 9 例，年齡 19 ～ 51 歲之間，平均年齡 34.25 歲，符合國家獻血者健康檢查標準。抽取全血 5 ml/（人）份，與 5% EDTA 抗凝劑混勻，4 ℃ 保存備用。留取單采血小板 3 ml，22 ℃ 振蕩保存。

1.1.2儀器和試劑BD FACSVerseTM流式細胞儀購自美國 BD 公司；淋巴細胞分離液購自挪威Axis-Shield 公司；別藻藍蛋白（APC）標記的抗人CD36 單克隆抗體、同型對照 APC 標記抗小鼠IgG1 抗體、異硫氰酸熒光素（FITC）標記的抗人CD14 單克隆抗體、FITC 標記的抗小鼠 IgG1 抗體均購自德國 Miltenyi 公司。

1.2方法

1.2.1標本處理將單采富血小板血漿轉入另一試管，1200 × g 離心 5 min。棄去上層血漿，用 PBS洗滌血小板 2 次，然后把血小板懸浮在 PBS 中，調整血小板濃度為 106個/ml。

1.2.2外周血單個核細胞分離取外周血標本5 ml，用 PBS 以 1:1 比例稀釋，應用淋巴細胞分離液分離外周血單個核細胞。取 5 ml 淋巴細胞分離液加入 15 ml 的離心管中，緩緩加入 5 ml 的稀釋的外周血，室溫條件下，2200 × g 離心 22 min，小心吸取分界面的白膜層細胞，用 PBS 洗滌 2 次，然后懸浮在 PBS 中，調整細胞濃度為 106個/ml。1.2.3血小板 CD36 表型的篩查取 100 μl 血小板懸液加入 10 μl APC 標記的抗人 CD36 單克隆抗體，APC 標記抗小鼠 IgG1 抗體作為同型對照，混勻，4 ℃ 避光孵育 10 min。1800 × g 離心5 min，洗滌 3 次，振蕩混勻，懸浮在 200 μl PBS中，流式細胞儀檢測，通過 FSC/SSC 設血小板門，以 Flow Jo 7.6.2. 軟件分析血小板表面的平均熒光強度（mean fluorescence intensity，MFI）。

1.2.4血小板 CD36 缺失型的表型分型血小板CD36 抗原缺失型樣本的 PBMCs 同時用 APC標記的抗人 CD36 單克隆抗體和 FITC 標記的抗人 CD14 單克隆抗體進行標記，取 100 μl 單個核細胞分別加入 10 μl APC 標記的抗人 CD36 單克隆抗體及 10 μl FITC 標記的抗人 CD14 單克隆抗體，在對照管中加入相應的同型對照抗體，混勻，4 ℃ 避光孵育 10 min，260 × g 離心 5 min，以PBS 洗滌 3 次，振蕩混勻，懸浮在 200 μl PBS 中，進行流式細胞儀檢測，通過 FSC/SSC 設單核細胞門，用 Flow Jo 7.6.2. 軟件分析。

1.3統計學處理

采用 Flow Jo 7.6.2. 分析軟件中的平均熒光強度（MFI）計算血小板和單核細胞表面 CD36 抗原的表達量，數據以x±s表示，用 t 檢驗進行統計分析，P < 0.05 具有統計學意義。

2　結果

2.1血小板表面 CD36 抗原表達的檢測

140 位無償獻血者中，共篩選出 4 名血小板表面 CD36 抗原缺失的個體（表1），代表性標本的流式細胞圖如圖1A 所示，CD36 抗原缺失型頻率為 2.86%（4/140）。

2.2單核細胞上 CD36 抗原的表達與 CD36 抗原缺失型的表型分析

對篩選出的 4 位血小板表面 CD36 抗原缺失型個體，用流式細胞儀檢測其單核細胞上 CD36 的表達，發現 1 人為 I 型 CD36 抗原缺失，3 人為II 型 CD36 抗原缺失（表2），所占比例分別為0.71% 和 2.14%。代表性標本的流式細胞圖見圖1B。

表1　血小板表面 CD36 抗原的表達檢測Table 1　Analysis of CD36 antigen expression on PLTs

圖1　典型檢測血小板（A）和單核細胞 CD36 抗原表達（B）的流式圖（a：正常個體同型對照；b：正常個體；c：I 型 CD36缺失個體；d：II 型 CD36 缺失個體；x 軸表示 APC的 MFI，y 軸在 A 中表示血小板計數，y 軸在 B 中表示單核細胞中 FITC 的 MFI）Figure 1　Representative pictures of flow cytometry analysis of CD36 expression on PLTs (A) and monocytes (B), respectively (a: Isotype control; b: Normal control; c: Type I CD36 deficiency; d: Type II CD36 deficiency; x axis showed the MFI of APC, and y coordinate showed counts of PLTs in A and showed the monocytes MFI of FITC in B)

表2　單核細胞 CD36 抗原的表達檢測Table 2　Analysis of CD36 antigen expression on monocytes

3　討論

CD36 抗原缺失分為兩型，I 型缺失是指在血小板和單核細胞上均不表達 CD36，而 II 型缺失是指僅在血小板上不表達 CD36。CD36 抗原缺失分布存在人種上的差異，本實驗結果顯示，江蘇地區獻血人群中的 CD36 缺失頻率和國內報道的廣州地區及南寧地區的相似[8-9]，略低于日本人，但遠高于白種人[7]。但值得注意的是：廣州地區漢族人群 CD36 抗原缺失均為 II 型缺失（2.81%），沒有發現 I 型缺失[8]；廣西地區漢族人群中發現 II 型缺失型頻率約為 2.18%，I 型缺失型頻率約為1.41%[10]；深圳地區漢族人群中發現 II 型缺失型頻率約為 2.75%，I 型缺失型頻率約為 0.31%[11]；而本實驗發現 II 型缺失型頻率約為 2.14%，I 型缺失型頻率為 0.71%。這些數據表明漢族人群 CD36抗原 II 型缺失型頻率可能分布在 1.50% ～ 2.81%，I 型缺失型頻率可能分布在 0 ～ 1.41%。Yamamoto 等[12]報道 CD36 抗原缺失 II 型在日本人群中約占 4.0%，I 型約占 0.56%，提示日本人群 CD36 缺失頻率高于中國人群，主要體現在 II 型缺失上。

CD36 抗原缺失的患者可產生抗 CD36 的同種抗體，從而造成血小板輸注無效、新生兒免疫性血小板減少癥等疾病，輸血后紫癜以及妊娠婦女流產和死胎的現象[2, 13]。Saw 等[2]報道 2 例 CD36抗原缺失的白血病患者輸注 HLA 配型相合的單采血小板后均發生輸注無效，實驗室檢測結果表明該患者為 CD36 缺失型，并且 CD36 抗體檢測為陽性。隨后在為該患者輸注 CD36 抗原陰性的獻血員單采血小板后，CCI 指數明顯上升。Ohto 等[13]報道了 CD36 抗原缺失的妊娠婦女產生 CD36 抗體從而引起胎兒/新生兒溶血病或死胎流產現象。

目前，血小板輸注無效已成為國內外臨床極棘手的問題，血小板輸注無效患者中 CD36 抗原缺失的頻率在國內偶有報道[3]，還沒有引起足夠的重視。但有證據表明血小板和（或）單核細胞上 CD36 抗原的缺失所產生的抗 CD36 的同種抗體與基因突變有關。下一步我們將繼續擴大篩查規模，積累更多的 CD36 缺失型供者，并深入研究 CD36 基因突變與抗原缺失的關系，這將有助于對血小板輸注無效及其他臨床疾病患者做個性化的治療，對提高輸血安全有重要的臨床意義。

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Author Affiliation: Jiangsu Province Blood Center, Nanjing 210042, China (CHEN Qing, CAI Li, CHEN Rong, XIAO Jian-yu, HUANG Cheng-yin); Institute of Dermatology, Chinese Academy of Medical Sciences & Peking Union Medical College, Nanjing 210042, China (DUAN Zhi-min); Blood Center of Shandong Province, Jinan 250014, China (ZHUANG Yun-long)

www.cmbp.net.cnChin Med Biotechnol, 2016, 11(1):38-41

·協會之窗·

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Analysis of CD36 antigen deficiency phenotypes on the platelets in Jiangsu Han population

CHEN Qing, DUAN Zhi-min, CAI Li, CHEN Rong, XIAO Jian-yu, HUANG Cheng-yin, ZHUANG Yun-long

【Abstract】

ObjectiveTo explore the polymorphisms of CD36 antigen deficiency on the platelets (PLTs) surface of the Han population in Jiangsu region.

MethodsFlow cytometry was used to detect the CD36 antigen expression on PLTs in 140 blood donors in Jiangsu region. Donors without CD36 antigen expression on their PLTs surface were further to be determined the expression of CD36 antigen on their peripheral blood monocyte cells.

ResultsOf the 140 healthy blood donors analyzed, 4 individuals failed to express CD36 antigen on PLTs and the rate of CD36 deficiency was 2.86%; One of them without CD36 on PLTS expressed no CD36 antigen on his PBMCs either. The rates of Type I and Type II CD36 deficiency among the study population were 0.71% (1/140) and 2.14% (3/140), respectively.

ConclusionThe CD36 antigen phenotype is polymorphic in the Jiangsu Han population, and the rate of the Type II CD36 deficiency was higher than that in Type I. The study findings indicated that the frequency of CD36 deficiency in the Chinese population is slightly lower than that in other Asian countries.

【Key words】Antigen, CD36;Platelet transfusion;Flow cytometry

Corresponding Author:ZHUANG Yun-long, Email: yunlongzhuang@gmail.com

收稿日期：2015-09-28

通信作者：莊云龍，Email：yunlongzhuang@gmail.com

基金項目：江蘇省重點研發計劃（社會發展）項目（BE2015717）；江蘇省“十二五”期間“科教興衛工程”醫學重點人才項目（RC2011088）；江蘇省第十批“六大人才高峰”項目（2013-WSW-039）；江蘇省第四期“333 高層次人才培養工程”；2010，2014 年度江蘇省衛生國際交流支撐計劃項目；山東省醫藥衛生科技發展計劃重點項目（2013WS0170）

DOI:10.3969/j.issn.1673-713X.2016.01.008