注射用免疫核糖核酸II的免疫調節及對順鉑的增效減毒作用

霍小位，王燦紅，馬曉玲，高麗，張蕾蕾，張麗靜，劉冬羽，韓嘉媛，李立勇，曹麗

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注射用免疫核糖核酸II的免疫調節及對順鉑的增效減毒作用

霍小位，王燦紅，馬曉玲，高麗，張蕾蕾，張麗靜，劉冬羽，韓嘉媛，李立勇，曹麗

【摘要】

目的探討注射用免疫核糖核酸 II（BP 素）對順鉑（DDP）的增效減毒作用及對 S180 荷瘤小鼠的免疫調節作用。

方法建立小鼠 S180 皮下移植瘤模型，隨機分組，采用腹腔注射給藥，連續給藥 10 d，通過白細胞（WBC）計數、骨髓有核細胞計數，取腫瘤、胸腺、脾臟稱重，計算抑瘤率、胸腺指數、脾臟指數以及 MTT 法檢測刀豆蛋白 A（ConA）誘導的小鼠脾臟 T 淋巴細胞增殖，觀察 BP 素對順鉑的增效減毒作用。通過 ELISA 法檢測血清中的 IL-1β、IL-6、TNF-α 水平，通過腹腔巨噬細胞對雞紅細胞吞噬率的測定評價 BP 素對 S180 荷瘤小鼠的免疫調節作用。

結果BP 素與 DDP 聯合應用可顯著提高 DDP 對 S180荷瘤小鼠的抗腫瘤作用（P < 0.01），明顯改善 DDP 化療所致的脾臟指數下降，外周血 WBC 數、骨髓有核細胞數的減少及脾臟 T 淋巴細胞增殖抑制等毒副作用（P < 0.01 或P < 0.05）；單用 BP 素可顯著降低荷瘤小鼠血清中的IL-1β、IL-6、TNF-α 水平（P < 0.01 或 P < 0.05），提高腹腔巨噬細胞吞噬雞紅細胞的吞噬率（P < 0.01）。

結論BP 素對 DDP 具有增效減毒作用，并對 S180 荷瘤小鼠具有免疫調節作用。

【關鍵詞】腫瘤；順鉑；免疫調節；BP 素

www.cmbp.net.cn中國醫藥生物技術, 2016, 11(1):32-37

作者單位：100193 北京，中國醫學科學院北京協和醫學院藥用植物研究所（霍小位、高麗、張蕾蕾、張麗靜、劉冬羽、韓嘉媛、李立勇、曹麗）；650500 昆明，云南中醫學院（王燦紅）；830002 烏魯木齊，新疆維吾爾自治區中藥民族藥研究所（馬曉玲）

腫瘤的發生與機體的免疫功能密切相關，當機體免疫功能異常時，腫瘤的發病率上升。而腫瘤快速生長時，會進一步抑制機體的免疫功能。順鉑（cis-dichlorodiamineplatinum，DDP）作為臨床常用的有效治療多種實體瘤的一線化療藥物，對腫瘤細胞具有較好的殺傷作用，但很容易引起肝腎毒性、消化道反應及免疫功能抑制等毒副作用，嚴重影響其治療效果及腫瘤患者的生存質量[1-2]。注射用免疫核糖核酸 II（商品名 BP 素）是使用現代化的工藝，從健康牛胰臟組織中提取的低分子 RNA[3]。臨床上，BP 素作為腫瘤患者術后及放、化療的輔助用藥取得了較好的治療效果[4]。在正常動物模型上也觀察到 BP 素具有增強免疫功能的作用[5]。但 BP 素聯合化療的減毒增效作用以及對腫瘤模型動物的免疫功能是如何發揮的仍有必要進一步闡明。本研究通過建立小鼠 S180 皮下移植瘤模型，研究 BP 素對順鉑的增效減毒作用及對 S180荷瘤小鼠的免疫調節作用，為臨床合理應用 BP 素提供參考。

1　材料與方法

1.1實驗材料

1.1.1藥品與試劑BP 素為吉林敖東藥業集團延吉股份有限公司產品；注射用順鉑為齊魯制藥有限公司產品；胸腺五肽注射液為海南中和藥業有限公司產品；RPMI Medium 1640 為美國 Gibco 公司產品；小鼠 IL-1β、IL-6、TNF-α ELISA 檢測試劑盒為上海拜力生物科技有限公司產品；特級胎牛血清為北京元亨圣馬生物技術研究所產品；四甲基噻唑藍（MTT）為美國 Amresco 公司產品。

1.1.2儀器BCN-1360 生物潔凈工作臺購自北京東聯哈爾儀器制造有限公司；5410 型二氧化碳培養箱購自美國 Napco 公司；MQX 200 型酶標儀購自美國 Bio-Tek 公司；CKX 41 熒光倒置顯微鏡購自日本 Olympus 公司；Labofuge 400R 離心機購自德國 Heraeus 公司；TT 快速細胞分析儀購自德國 Innovatis 公司。

1.1.3動物與瘤株雄性 ICR 小鼠，SPF 級，16 ～ 18 g，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，許可證號 SCXK（京）2012-0001。按嚙齒類動物飼養方法和條件飼養于 SPF 級動物房。S180瘤株由本實驗室常規傳代保存。羊血購自北京大學醫學部動物中心；雞血由中國農業大學動物醫學院饋贈。

1.2方法

1.2.1小鼠 S180 皮下移植瘤模型的建立將凍存的 S180 瘤株復蘇，體外培養，取對數生長期的S180 細胞用無菌生理鹽水洗 3 次，調整濃度為2.5 × 106個/ml，小鼠腹腔注射 0.2 ml/只，連續傳2 代。無菌條件下抽取生長良好的腹水瘤小鼠的腹水，用細胞分析儀計數活細胞數 ≥ 95%。用無菌生理鹽水調整細胞濃度為 5.0 × 106個/ml，于小鼠右側腋窩皮下接種，0.2 ml/只。

1.2.2BP 素對順鉑增效減毒作用

1.2.2.1分組及給藥建立 S180 荷瘤小鼠模型，并隨機分為模型組、DDP 組、BP 素低 + DDP組、BP 素中 + DDP 組、BP 素高 + DDP 組，每組 10 只，另設空白對照組。空白對照組、模型組小鼠腹腔注射生理鹽水 10 ml/kg，1 次/d；DDP 組腹腔注射 DDP 2 mg/kg，1 次/2 d；BP 素低 + DDP組、BP 素中 + DDP 組、BP 素高 + DDP 組分別腹腔注射 BP 素 25、50、100 mg/kg，1 次/d，同時腹腔注射 DDP 2 mg/kg，1 次/2 d。以上各組連續給藥 10 d。

1.2.2.2BP 素聯合順鉑對 S180 荷瘤鼠抑瘤率及臟器指數的影響末次給藥 24 h 后，稱體重，摘眼球取血并頸椎脫臼處死小鼠，剝離瘤體、胸腺、脾臟，用電子天平精密稱重，計算抑瘤率和臟器指數。抑瘤率 =（模型組平均瘤重 – 治療組平均瘤重）/模型組平均瘤重 × 100%，臟器指數 = 免疫器官質量（mg）/體重（g）。

1.2.2.3BP 素聯合順鉑對外周血 WBC 數的影響末次給藥 1 h 后，小鼠尾尖取血 10 μl，加入到 190 μl 的 3% 稀醋酸中，輕彈 EP 管使紅細胞充分裂解，在顯微鏡下計數。

1.2.2.4BP 素聯合順鉑對骨髓有核細胞數的影響末次給藥 24 h 后，剝離右側股骨，用 1 ml 注射器吸取 0.3 ml Hank's 液通過針頭反復沖洗骨髓，用 3% 稀醋酸稀釋 10 倍后于血細胞計數板上計數骨髓有核細胞數。

1.2.2.5BP 素聯合順鉑對刀豆蛋白 A（ConA）誘導的小鼠脾淋巴細胞增殖的影響末次給藥 24 h后，無菌取脾，常規制備脾細胞懸液。用含 10%胎牛血清的 RPMI 1640 培養基將脾細胞濃度調整為 5 × 106個/ml。將脾細胞懸液加入 48 孔培養板中，每孔 300 μl。再加入 300 μl ConA 液（終濃度7.5 μg/ml），置 37 ℃、5% CO2孵箱中培養 68 h 后加入 MTT（5 mg/ml）30 μl/孔，繼續培養 4 h。培養結束后，每孔小心吸取 240 μl 上清液棄去，然后加入 240 μl 細胞裂解液，置 37 ℃、5% CO2孵箱中過夜。在酶標儀上于 570 nm 波長處測定吸光度（A）。

1.2.3BP 素對 S180 荷瘤小鼠免疫調節作用

1.2.3.1分組及給藥接種 S180 瘤株 24 h 后，將小鼠隨機分為模型對照組、胸腺五肽注射液組、BP 素低劑量組、BP 素高劑量組，每組 10 只，另設正常對照組。正常組、模型組腹腔注射生理鹽水10 ml/kg，1 次/d；胸腺五肽注射液組腹腔注射胸腺五肽 7.64 mg/kg，1 次/d；BP 素低劑量組腹腔注射BP 素 12.5 mg/kg，1 次/d；BP 素高劑量組腹腔注射 BP 素 50 mg/kg，1 次/d，以上各組連續給藥 10 d。

1.2.3.2BP 素對 S180 荷瘤鼠血清中 IL-1β、IL-6、TNF-α 水平的影響末次給藥 24 h 后，摘眼球取血，4 ℃ 放置約 1 h，使血清充分析出，3000 r/min 離心 10 min 分離血清，用 ELISA 試劑盒測定血清中的 IL-1β、IL-6、TNF-α 水平。

1.2.3.3BP 素對 S180 荷瘤小鼠腹腔巨噬細胞吞噬雞紅細胞的影響于給藥第 7 天小鼠腹腔注射 2%（v/v）綿羊紅細胞（SRBC）懸液 0.2 ml/只，免疫 4 d。于末次給藥 24 h 后所有動物脫頸椎處死，于無菌條件下，腹腔注射含 5% FBS 的 Hank's 液 2 ml/只，輕揉腹腔 10 次并吸取腹腔洗液移至試管內。將 0.3 ml 腹腔洗液與 0.3 ml 1% 的雞紅細胞懸液混勻，滴于玻片上并輕輕推平，于 37 ℃ 孵育 30 min。30 min 后用生理鹽水沖洗玻片，甲醇固定 1 min，吉姆薩染液染色 12 min。玻片用蒸餾水沖洗并晾干。油鏡下觀察吞噬情況，計數 100 個巨噬細胞中吞噬雞紅細胞的巨噬細胞數，用以下公式計算吞噬率。

吞噬率 =（吞噬雞紅細胞的巨噬細胞數/計數的巨噬細胞總數）× 100%

1.3統計學處理

采用統計軟件 SPSS 17.0 進行單因素方差分析，比較組間差異性，實驗數據用x±s表示，P < 0.05 認為差異有統計學意義。

2　結果

2.1BP 素聯合順鉑給藥對 S180 荷瘤小鼠抑瘤率的影響

各給藥組均有明顯的抑瘤作用，與模型組相比有顯著性差異（P < 0.01）。BP 素中 + DDP 組、BP 素高 + DDP 組的瘤重明顯低于單用 DDP 組（P < 0.01），抑瘤率分別為 63.25% 和 60.41%，表明 BP 素中、高劑量對 DDP 的抑瘤效果有顯著的增效作用，見表1。

2.2BP 素聯合順鉑給藥對荷瘤小鼠免疫器官指數的影響

與空白對照組相比，模型組荷瘤小鼠的脾臟指數明顯增大（P < 0.01）。DDP 組荷瘤小鼠脾臟指數顯著降低，與模型組比較有顯著性差異（P < 0.01）。BP 素中 + DDP 組、BP 素高 + DDP 組可明顯逆轉 DDP 引起的脾臟指數下降（P < 0.05）。小鼠接種 S180 后，模型組荷瘤小鼠的胸腺指數沒有顯著性變化。與模型組比較，DDP 組荷瘤小鼠的胸腺指數略有下降，但是沒有顯著性差異。BP 素低 + DDP 組、BP 素中 + DDP 組、BP 素高 + DDP組的胸腺指數與 DDP 組比較也沒有顯著性差異（表2）。

2.3BP 素聯合順鉑給藥對荷瘤小鼠外周血 WBC數、骨髓有核細胞數的影響

小鼠接種 S180 后，模型組荷瘤小鼠的外周血WBC 數顯著增加（P < 0.01）。與模型組相比，單用 DDP 組荷瘤小鼠的外周血 WBC 數顯著減少（P < 0.05）。BP 素高 + DDP 組結果顯示 BP 素可明顯改善單用 DDP 引起的外周血 WBC 數的減少（P < 0.01）。小鼠接種 S180 后，模型組荷瘤小鼠的骨髓有核細胞數略有下降，但無顯著性差異。DDP 組小鼠的骨髓有核細胞數與模型組比較顯著減少（P < 0.05），BP 素低 + DDP 組、BP 素中 + DDP 組可明顯改善 DDP 引起的骨髓有核細胞數的減少（P < 0.05）（表3）。

2.4BP 素聯合順鉑給藥對荷瘤小鼠脾臟 T 淋巴細胞增殖的影響

小鼠接種 S180 后，模型組荷瘤小鼠脾臟 T 淋巴細胞的增殖沒有顯著性變化。單用 DDP 組荷瘤小鼠脾臟 T 淋巴細胞的增殖與模型組比較略有下降，無顯著性差異，但顯著低于正常組。與 DDP 組比較，BP 素低 + DDP組、BP 素中 + DDP 組、BP 素高 + DDP 組可顯著提升脾臟 T 淋巴細胞的增殖（P < 0.01），見表4。

表1　BP 素聯合順鉑給藥對小鼠 S180 移植瘤的影響（x±s ）Table 1　Inhibition of various treatments on S180 tumor (x±s )

表2　BP 素聯合順鉑給藥對胸腺指數、脾臟指數的影響（x±s ）Table 2　Effect of various treatments on thymus index and spleen index (x±s )

表3　BP 素聯合順鉑給藥對外周血 WBC 數、骨髓有核細胞數的影響（x±s ）Table 3　Effect of various treatments on peripheral white blood cells (WBC) and bone marrow nucleated cells (x±s )

表4　BP 素聯合順鉑給藥對脾臟 T 淋巴細胞增殖的影響（x±s ）Table 4　Effect of various treatments on T lymphocyte proliferation (x±s )

2.5BP 素對 S180 荷瘤鼠血清中 IL-1β、IL-6、TNF-α 水平的影響

與空白組比較，模型組小鼠血清中的 IL-1β、IL-6、TNF-α 水平顯著升高（P < 0.01）。BP 素高、低劑量給藥組及陽性藥胸腺五肽注射液組小鼠血清中的 IL-1β、IL-6、TNF-α 水平與模型組相比均顯著下降（P < 0.01，P < 0.05），見表5。

2.6BP 素對 S180 荷瘤小鼠腹腔巨噬細胞吞噬雞紅細胞的影響

與空白組相比，模型組小鼠腹腔巨噬細胞的吞噬率明顯下降。BP 素高、低劑量給藥組及陽性藥胸腺五肽注射液組小鼠腹腔巨噬細胞的吞噬率與模型組比較顯著升高（P < 0.01），見表6。

3　討論

惡性腫瘤是嚴重威脅我國人民生命健康的疾病之一。包括順鉑在內的化療藥是治療惡性腫瘤的常規方法之一，但大多數化療藥物缺乏腫瘤特異性，在殺傷腫瘤細胞的同時也對包括免疫細胞在內的分裂增殖旺盛的正常細胞具有殺傷作用，產生骨髓抑制，影響 T、B 淋巴細胞、巨噬細胞等免疫細胞正常的增殖活化，從而引起機體免疫功能的抑制，嚴重影響到惡性腫瘤的治療[6]。因此，提高機體的免疫功能，增強化療藥物的療效，降低其毒性，尤其是防治患者化療后出現的免疫功能抑制，是有效治療惡性腫瘤的關鍵。本實驗采用小鼠的 S180皮下移植瘤模型，研究 BP 素對順鉑的增效減毒作用及其免疫調節作用。實驗結果表明，在 S180 荷瘤小鼠中應用亞適劑量的 DDP（2 mg/kg），已具有明顯的抑瘤效果，但同時引起了免疫器官指數，外周血 WBC 數、骨髓有核細胞數下降、T 淋巴細胞增殖抑制等免疫功能低下，與文獻[7-9]報道一致。BP 素與 DDP 聯合應用可顯著提高 DDP 對小鼠S180 實體瘤的抑瘤作用，抑瘤率從單用 DDP 的35.82% 提高到 63.25%。同時，BP 素與 DDP 聯合應用對 DDP 引起的脾臟指數、外周血 WBC數、骨髓有核細胞數下降及 T 淋巴細胞增殖抑制等免疫功能低下狀態也具有一定的改善作用，進一步證實了臨床觀察到的 BP 素主要通過提高患者的免疫功能而發揮其抗腫瘤、改善患者生活質量的作用[3]。

細胞因子是參與腫瘤發病的短效可溶性介質[10]。這些因子的長期合成和釋放會導致它們在血清中的濃度升高，可以作為反應機體免疫狀態和腫瘤預后的標志物[11]。據報道，荷瘤動物中的 IL-1β、IL-6等炎性因子水平升高，對腫瘤的增殖、分化、侵襲、遷移以及黏附具有明顯的促進作用。降低這些因子的水平對腫瘤的治療具有積極的意義[12]。TNF-α 也是一種重要的促炎因子，它可以通過 TNF-α 受體以及通過激活包括 caspase-8 和 caspase-3 在內的細胞內信號級聯反應來誘導凋亡[13]。但是，腫瘤患者血清中高水平的 TNF-α 與腫瘤的侵襲相關。阻斷 TNF-α 成為腫瘤治療的新策略[12]。小鼠接種S180 瘤株以后，會出現血清 IL-1β、IL-6、TNF-α 水平上升，腹腔巨噬細胞吞噬功能下降等免疫抑制狀態，這與文獻[14]報道基本一致。給予 BP 素治療后，荷瘤小鼠血清中的 IL-1β、IL-6 水平明顯降低，TNF-α 的水平也有所下降，腹腔巨噬細胞的吞噬能力顯著增強。以上結果提示：BP 素對荷瘤小鼠的免疫功能具有一定的調節作用，并可對抗化療藥物DDP 所導致的機體免疫功能的抑制，使機體的免疫功能得到恢復，提高機體的抗腫瘤能力。

綜上所述，BP 素在腫瘤化療中具有增效減毒作用，并可調節機體的免疫功能，在腫瘤的治療中具有積極意義。但對其作用的確切機制還有待深入研究。

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Author Affiliation: Institute of Medicinal Plant Development, Chinese Academy of Medical Sciences & Peking Union Medical College, Beijing 100193, China (HUO Xiao-wei, GAO Li, ZHANG Lei-lei, ZHANG Li-jing, LIU Dong-yu, HAN Jia-yuan, LI Li-yong, CAO Li); Yunnan University of Traditional Chinese Medicine, Kunming 650500, China (WANG Can-hong); Xinjiang Institute of Chinese Materia Medica and Ethnodrug, Urumqi 830002, China (MA Xiao-ling)

www.cmbp.net.cnChin Med Biotechnol, 2016, 11(1):32-37

·論著·

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Effects of BP on modulating sensitivity and toxicity of cisplatin and regulating immune function in S180 tumor-bearing mice

HUO Xiao-wei, WANG Can-hong, MA Xiao-ling, GAO Li, ZHANG Lei-lei, ZHANG Li-jing, LIU Dong-yu, HAN Jia-yuan, LI Li-yong, CAO Li

【Abstract】

ObjectiveTo investigate the effects of BP on modulating sensitivity and toxicity of cisplatin and regulating immune function in S180 tumor-bearing mice.

MethodThe S180 tumor-bearing mice model was established and consecutively administrated with BP alone (12.5, 50 mg/kg, i.p.), DDP alone (2 mg/kg, i.p.) or BP + DDP (25, 50, 100 mg/kg + 2 mg/kg) for 10 days. To evaluate the synergistic antitumor and attenuated effects of BP combined with DDP, peripheral white blood cells (WBC) and bone marrow nucleated cells were calculated. Also tumor, thymus and spleen were weighed and tumor inhibition rate, thymus and spleen index were measured, and ConA-induced T cells proliferation was also conducted by MTT assay. To evaluate the immune regulatory effect of BP, serum levels of IL-1β, IL-6 and TNF-α were detected by ELISA and phagocytic ratio of peritoneal macrophages was calculated.

ResultBP combined with DDP could significantly enhance the antitumor effect (P < 0.01). BP significantly reversed DDP-induced reduction of spleen index, WBC and bone marrow nucleated cells (P < 0.01 or P < 0.05). BP combined with DDP could also significantly improve T cells proliferation (P < 0.01 or P < 0.05). Moreover, BP could obviously decrease levels of IL-1β, IL-6 and TNF-α in serum (P < 0.01 or P < 0.05) and improve the phagocytic ratio (P < 0.01).

ConclusionBP combined with DDP has synergistic antitumor effect and attenuated DDP-induced toxic effects in S180 tumor-bearing mice. Moreover, BP has immunomodulatory effects in S180 tumor-bearing mice.

【Key words】Neoplasms;Cisplatin;Immunomodulation;BP

Corresponding Author：CAO Li, Email: lcao@implad.ac.cn

收稿日期：2015-10-19

通信作者：曹麗，Email：lcao@implad.ac.cn

基金項目：“重大新藥創制”國家科技重大專項（2012ZX09301002-001-026)

DOI:10.3969/j.issn.1673-713X.2016.01.007