血管性癡呆動物模型的研究概述

胥青梅，白 雪

血管性癡呆動物模型的研究概述

胥青梅，白 雪

血管性癡呆(VD)是由各種腦血管疾病引起的獲得性智能損害綜合征的總稱。建立可靠的動物模型來模擬人類缺血性腦血管病的發病過程是研究VD發生發展機制及防治措施、療效評價的關鍵。故建立一種重復性好、評價指標控制嚴格、便于操作和觀察、符合不同實驗研究目的的VD動物模型，一直是研究者們追求的目標。本研究對近年來常用的VD動物造模方法以及不同方法所造VD模型的應用進行簡要綜述，以期為今后的實驗研究提供借鑒。

血管性癡呆；模型；血管阻斷法；高脂血癥；中醫證型

血管性癡呆(vascular dementia，VD)是由腦出血、缺血或急慢性腦缺氧等腦血管疾病引起腦組織損傷，從而導致腦功能減退的一種智能障礙綜合征[1]。在我國，VD的發病率和患病率不斷增加，但其確切的病因病機至今仍未闡明，也缺乏特異高效的防治措施。因此，建立合理的VD動物模型對于深入探討VD的病因、發病機制和研究新的治療策略等均有重大意義?，F將目前國內外VD模型的研究現狀作一綜述。

1 VD造模動物的選擇

用于VD造模的動物應滿足兩個基本條件，一是其腦血管解剖結構特點和人腦相似，二是其神經系統和感覺運動系統應高度發達，對缺血缺氧等刺激能準確感知并迅速作出反應。鼠類動物不但非常符合這兩個條件，而且具有較其他動物經濟實惠、來源明確、易于飼養、便于操作、可控性強、生命力強等諸多優點[2]。因此，鼠是目前實驗室制備VD模型最常用的動物。實驗室鼠類造模動物包括大鼠、小鼠、沙鼠和豚鼠等多個品系。其中，以大鼠和小鼠的腦血管生理結構與人腦最為相似，均由頸動脈系及椎基底動脈系在腦底吻合，形成Willis動脈環，經此動脈環的分支共同完成腦的血液供應。大鼠和小鼠相比，大鼠具有體型相對較大，便于進行造模操作及造模后智能測試、行為學觀察、影像學及電生理檢查等優勢，故成為VD造模最適宜的動物。

2 造模方法

目前國內外研究報道的VD大鼠模型制備方法包括血管阻斷法、血管栓塞法、光化學法、去大腦皮層法、轉基因法、立體定向內皮素-1顱內注射法、M-受體東莨菪堿顱內注入法等。其中以血管阻斷法和血管栓塞法應用最為廣泛。近年來，由于中醫藥特色療法在臨床VD治療過程中優勢凸顯，部分研究者也開始探索一些與中醫證型相關的VD造模方法。

2.1 血管阻斷法 血管阻斷法是指采用夾閉或結扎大鼠頸部動脈血管的方式以減少腦的血供，造成腦組織慢性缺血缺氧損傷。根據所阻斷動脈血管數目的不同，血管阻斷法可分為兩血管阻斷法(2-VO)和多血管阻斷法(3-VO、4-VO)。隨著研究的不斷深入，許多研究者嘗試將血管阻斷法不斷改良，并糅合了高脂血癥、高血壓、糖尿病等腦血管疾病的危險因素，以滿足不同研究目的的需要。

2.1.1 兩血管阻斷法及改良 2-VO法是指分離出大鼠雙側頸總動脈后將其永久性結扎，造成腦組織慢性缺血缺氧損傷[3]。此法操作簡便，重復性好，造模前后大鼠學習記憶能力明顯降低，且不伴有神經功能缺損的癥狀，因此2-VO法被廣泛用于各類慢性缺血性疾病所致的VD研究。該方法不足之處為一次性阻斷了大鼠雙側頸總動脈，手術打擊很大，術中大鼠死亡率高，術后難以長期存活，不利于觀察。

王興華等[4]對2-VO法改良，將同時結扎大鼠雙側頸總動脈改為間隔一星期分2次先后結扎大鼠兩側頸總動脈。由于減輕了一次手術的損傷程度，改良后的2-VO法顯著降低了造模過程中大鼠的死亡率。在模型評價方面，吳章福等[5]通過比較傳統2-VO法與該改良2-VO法所造VD模型的行為學和組織形態學指標，認為改良后2-VO法可以復制大鼠腦組織長期慢性灌注不足引起的VD模型，且與臨床慢性腦缺血的病理過程更接近。由于改良2-VO法使VD模型大鼠術后存活率提高，因此該方法更加適用于藥物起效慢、觀察周期長的腦血管永久性閉塞的VD實驗研究。

為了更好地模擬VD發病過程中反復慢性腦缺血再灌注損傷，王蕊等[6]先給大鼠腹腔注射硝普鈉(2.5 mg/kg)，然后用動脈夾將大鼠雙側頸總動脈反復夾閉和再通兩次，每次夾閉和再通時間均持續10 min。此法中使用硝普鈉能降低大鼠血壓，減少腦灌注，抑制了Willis動脈環的調節、代償作用，提高了腦缺血再灌注損傷的可信度。術中無需結扎大鼠雙側頸總動脈，手術操作簡單，對動物創傷小，術后易于恢復，存活率高，模型重復性、穩定性較好。但本法中硝普鈉注射量對血壓的影響及環境溫度的變化都會影響造模效果[7]。

2.1.2 2-VO+高脂血癥因素 王義義等[8]先用高脂飼料(由普通飼料78.8%+膽固醇1%+牛膽鹽0.2%+蛋黃粉10%+豬油10%組成)喂養大鼠3周制備高脂血癥大鼠模型，經鼠尾靜脈采血確定大鼠體內血脂水平已升高(三酰甘油2.53 mmol/L±0.89 mmol/L)以后，再用傳統2-VO法造模，制成高脂血癥VD模型。造模30 d經電生理指標評價發現該法較傳統2-VO法加重了大鼠海馬區的短時程增強(STP)損傷，而對于長時稱增強(LTP)沒有顯著性影響。此造模過程加入了高脂危險因素，適用于研究高脂血癥與VD發病的關系及高脂血癥合并VD的治療等。

2.1.3 2-VO+糖尿病因素 宋莉莉等[9]將鏈脲佐菌素(STZ)以55 mg/kg的劑量注入雄性SD大鼠腹腔，導致大鼠胰腺的β-細胞破壞，3 d后由鼠尾靜脈采血測血糖，將隨機血糖持續>16.7 mmol/L者視作符合慢性糖尿病標準的大鼠，再對這些大鼠用2-VO法造模，制成糖尿病VD模型。此法模擬了VD發病中糖尿病危險因素，適用于研究糖尿病與VD發病的關系及糖尿病合并VD的治療等。

2.1.4 2-VO+高血壓因素 莫飛智等[10]先夾閉大鼠雙側腎動脈，復制出腎血管性高血壓大鼠模型，再用2-VO法造模，制成高血壓VD模型。此法模擬了VD發病中高血壓危險因素，適用于研究高血壓與VD發病的關系。

自發VD模型也被用來研究高血壓與VD的發病關系。自發性高血壓大鼠是一種人工培育的近交系大鼠。該品系大鼠具有穩定的高血壓遺傳性，一般在出生后3個月～4個月后即自然形成穩定的高血壓，并進而出現包括高血壓腦出血在內的多種并發癥[11]。研究者可由這些高血壓腦出血后存活下來的大鼠中篩選VD模型。自發VD模型與其他以正常大鼠為基礎制作的VD模型相比，更好地模擬了在長期高血壓基礎上大腦持續低灌流致VD發病的這一病理生理過程[12]。但這類VD模型為高血壓腦出血所致，與臨床上大多數VD病人由腦缺血所致的發病機制不同[13]。

2.1.5 2-VO+多重復合危險因素 邵瑛等[14]選用“雙腎一夾”法復制出高血壓大鼠模型，1 周后開始以高脂飼料喂食20 d，篩選出高血壓-高血脂(雙高)模型大鼠，再用2-VO法復制出高血壓-高血脂復合血管性癡呆(HH-VD)模型。該法在一次造模過程中同時考慮到多種VD發病的危險因素，旨在模擬臨床老年病人基礎疾病較多的情況下VD的發病病理生理過程。該方法對研究多重危險因素與VD發病的關系提供了新的思路。雖然與人類VD發病過程具有較高的相似度，但多種危險因素綜合在一起，使研究過程中的不確定因素增加，降低了實驗的可靠性。

2.1.6 多血管阻斷法 傳統的3-血管阻斷法采用先電凝基底動脈再夾閉雙側頸總動脈制備VD模型。該方法能致大鼠腦組織迅速缺血，且缺血效果可靠，但在電凝基底動脈時，極易傷及延髓，操作難度大，手術創傷嚴重。Horecky等[15]將該法加以改良，首先結扎基底動脈，再反復夾閉和再通雙側頸總動脈，形成大鼠腦缺血再灌注損傷，經Morris水迷宮檢測，證實此3-VO模型大鼠空間學習記憶能力的損害穩定，模型成功率高。該方法還可以通過控制頸總動脈缺血時間來控制大鼠腦缺血程度。Pusinelli采用先結扎大鼠雙側椎動脈，再可逆性夾閉雙側頸總動脈制備VD模型，即4-血管阻斷法。此法導致全腦缺血，缺血后病理改變充分。但該方法操作復雜，且對大鼠腦組織血循環損害嚴重，動物死亡率高。楊曉妮等[16]在此法基礎上進行改良，用直徑約為0.5 mm的電凝針灼燒雙側翼小孔內的椎動脈，使之永久性閉塞，再可逆地反復夾閉和再通雙側頸總動脈。改良后的4-VO法避免了分離、結扎大鼠雙側椎動脈，操作更簡單，損傷更小。多血管阻斷法VD模型缺血迅速，缺血效果可靠，適用于研究急性腦缺血損傷。

2.2 血管栓塞法 血管栓塞法也是實驗室制備VD模型的常用方法。血管內栓塞的栓子成分對于模型的成功率至關重要。研究者們在栓子成分的選擇上也是做了諸多嘗試?？諝?、纖維蛋白、血凝塊、浮石、玻璃球、鋼微球、罌粟籽、煙草籽、絲線、尼龍線、硅橡膠、石蠟、鐵粉、金球、銀球、花生四烯酸鹽等均被報道用作制備VD模型的栓子。目前較常用的是血凝塊、石蠟、鐵粉和絲線。

2.2.1 注入血栓法 1982年由Kudo等將大鼠自體血凝塊搗碎后篩選出直徑小于100 μm的血栓栓子從大鼠一側頸總動脈注入并結扎，此血栓注入法不僅造成了大鼠同側皮質、海馬和深部灰質的梗死，而且造成大鼠的認知功能損害。梅建勛等[17]將此法加以改進，先夾閉頸總動脈，將同種大鼠自體干燥血凝塊研碎后篩選出直徑小于200 μm的微粒制成栓子溶液，取0.3 mL由頸內動脈緩慢注入，注入時間不少于30 s，同時開放頸總動脈，使栓子隨頸總動脈的血流進入顱內。在改良的血栓注入法中，栓子微粒直徑的增大可以造成更為確切的腦梗死，血栓注入方式的改良更好地模擬了人體血栓入腦的過程，而栓子溶液量的減少則降低了造模動物的手術死亡風險。由于栓子進入顱內后停留的部位不固定，因此采用血栓注入法制備的VD模型梗死部位也不固定，梗死灶大小不好控制。

2.2.2 注入石蠟法 從大鼠胸骨左緣心跳最明顯處進針(距中線約0.5 cm，進針0.5 cm～1 cm)，回抽見鮮血后將小劑量液狀石蠟注入左心室，液狀石蠟栓子隨著血液循環進入顱內造成大鼠多發性腦缺血模型。研究表明向大鼠體內注入小劑量液狀石蠟僅可使腦組織產生多發性梗死，而不會使其他器官發生缺血性改變。腦組織病理學檢查發現此法所致腦梗死灶多發生在腦白質，呈多個島樣，部分大腦皮質及海馬的神經細胞也會出現缺血性改變[18]。該方法避免了頸部手術，操作簡單，創傷小，術后感染發生率低，適用于藥物療效等長期性觀察研究。其不足之處在于栓子進入顱內后造成的梗死部位不確定。

2.2.3 注入鐵粉法 注入鐵粉法是在大鼠顱外安置小磁鐵后由舌下靜脈注入鐵粉，通過磁鐵的引導作用使鐵粉聚集到指定區域，造成相應區域的腦血管栓塞。造模后大鼠通過行為學觀察、電迷宮檢測和分析類P3電位的變化，認為建立了可靠的VD模型。趙小貞等[19]就此法與2-VO法進行了對比，認為二法均可建立可靠的VD動物模型。注入鐵粉法利用磁鐵的引導很好地解決了傳統栓塞法所制VD模型梗死部位不確定這一難題，同時還具有微創、易操作、模型重復性好等優點，但此法制備的VD模型腦梗死部位單一，與臨床VD常為顱內多發病灶的特點存在一定的差異。此外，鐵粉本身是否會對腦組織產生理化影響尚不明確。

2.2.4 大腦中動脈線栓法 尹軍祥等[20]將尼龍線從頸內靜脈插入后實現大腦中動脈阻塞導致腦缺血，2 h后向外提拉線頭使大腦中動脈再灌注，形成腦梗死模型。該法避免了開顱損傷，動物神經功能缺損嚴重，因此容易獲得VD模型，成模率高。但該法受線栓的種類、線栓的制備方法、線栓的插入方法和入腦深度等因素影響較大[21]，對實驗者操作要求較高，模型穩定性和重復性較差。

2.3 其他的西醫造模方法 尚有光化學誘導法、去大腦皮層法、立體定向內皮素-1顱內注射法、M-受體東莨菪堿顱內注入法、轉基因法等，但由于難以排除外源性干擾、手術創傷重、技術難度大、費用高昂等原因限制其科研大規模應用。

2.4 模擬中醫證型的VD造模方法 為了進一步研究中醫藥對VD的防治作用，已有學者嘗試做了模擬中醫證型的VD模型研究。易亞喬等[22]運用“勞則耗氣”的原理，對模型組大鼠經行為期3周的力竭游泳訓練后采用2-VO法造模，由此認為建立了氣虛血瘀型VD模型。萬睿等[23]采用高脂乳劑連續灌胃大鼠15 d后再以2-VO法造模，即認為構建了脈絡瘀滯型VD模型。這類中醫證型的研究對于癥候因素的控制是模型成功與否的關鍵。此外，由于缺乏有效的證型評價指標，中醫的造模方法是否模擬了預期的證型尚待考究。

3 VD模型的評價方法

根據國際血管性行為與認知障礙學會的聲明，VD的診斷需要考慮兩個方面：一是確定存在認知功能障礙；二是確定血管疾病是引起認知缺陷的主要但非唯一的病因[24]。VD模型是否造模成功的評判自然也要從這兩點出發。任何一個VD模型，只有同時滿足存在認知功能障礙和認知功能障礙主要由血管損傷所致這兩個條件，才能被認為是合格的。認知功能的檢測主要包括動物的學習、記憶、避害、辨識能力，檢測方法包括跳臺法、避暗法、穿梭箱法、迷宮實驗等，其中以Morris水迷宮應用最為廣泛。血管損傷的檢測包括如血沉、紅細胞比容等血液流變學檢測及損傷部位腦組織的病理學檢測。造模前后海馬區神經細胞的時程增強、凋亡情況及Bax、Bcl-2、Caspase-3、AVP、Aβ1-40等蛋白表達的變化情況均是常見的模型評價指標。模擬中醫證型的VD造模方法目前尚缺乏有效的證型評價指標。

4 VD模型評價時間的選擇

文獻報道成模時間點在術后的3 d～28 d。孫潔薈等[25]通過比較分析造模術后1 d、7 d、14 d、21 d、28 d大鼠模型海馬神經元的組織病理學和超微結構變化，發現上述不同時間點大鼠海馬CA1區神經元數量均顯著減少，其中以術后14 d組海馬CA1區神經元最少，超微結構顯示神經元變性、核固縮最明顯，此后隨著側支循環的建立，腦血流不斷恢復，海馬神經元數量開始增加，神經元損傷逐漸改善。因此，觀察時間點應選擇在造模成功后2周為宜。

5 小結與展望

VD造模方法種類繁多，各有優劣，目前尚無證據表明某種造模方法明顯優于其他。研究者應綜合考慮研究目的、實驗環境、技術能力、經濟情況等多個因素選擇適當的造模方法。近年來，中醫診療方法在臨床VD的防治中優勢凸顯，研究顯示中西醫結合治療對于病人自覺癥狀、精神神經癥狀改善以及提高長谷川癡呆量表(HDS)、日常生活能力量表(ADL)的評分均優于單純西醫治療[26]。但中醫治療講究分證論治，而目前國內外鮮有復制中醫證候VD模型方法和相關證型評價標準的報道。而西醫的造模方法經過大量研究，無論是在造模技術還是模型評價指標方面，均已較為成熟。因此如何在傳統西醫的造模方法基礎上巧妙地融入不同中醫證候要素，從而創建新的VD動物模型對研究VD的防治具有重大意義，這也是今后探索、努力的方向。

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(本文編輯郭懷印)

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10．3969/j．issn．1672-1349．2016．04．018

1672-1349(2016)04-0391-04

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