瓜蔞提取物治療鏈脲佐菌素誘導糖尿病小鼠心肌纖維化的實驗研究

厲 娜，黃志剛，梁 春，岳溫恒，吳宗貴

·基礎醫學論著/研究·

瓜蔞提取物治療鏈脲佐菌素誘導糖尿病小鼠心肌纖維化的實驗研究

厲 娜，黃志剛，梁 春，岳溫恒，吳宗貴

目的 觀察瓜蔞提取物對鏈脲佐菌素誘導糖尿病小鼠心肌纖維化的治療作用。方法 采用鏈脲佐菌素誘導C57BL/6J小鼠糖尿病模型，瓜蔞提取物選取瓜蔞皮注射液作為研究藥物，觀察正常對照組、鏈脲佐菌素(STZ)組、STZ+低劑量瓜蔞組和STZ+高劑量瓜蔞組小鼠體重、隨機血糖、心功能、左室心肌膠原容積分數、左室心肌肥大細胞數目、α-平滑肌肌動蛋白(α-SMA)和轉化生長因子β1(TGF-β1)的表達變化。結果 STZ組小鼠體重下降、血糖升高、左室肥大細胞浸潤數目增加、左室膠原容積分數增加，免疫組織化學染色顯示α-SMA和TGF-β1表達增加。治療組左室肥大細胞浸潤數目降低、左室膠原容積分數減少，免疫組織化學染色顯示α-SMA和TGF-β1表達減少，瓜蔞高劑量組優于低劑量組。結論 瓜蔞皮注射液可以改善STZ誘導糖尿病小鼠的心肌纖維化，可能機制為抑制肥大細胞在心肌組織中的浸潤和激活。

糖尿病性心肌病；心肌纖維化；瓜蔞提取物；肥大細胞；α-平滑肌肌動蛋白；轉化生長因子β1

2014年全球糖尿病病人已超過3.87億，僅2014年糖尿病病人死亡人數就達到490萬人[1]。而在糖尿病病人死亡人群中，心血管疾病死亡占65%左右[2]。糖尿病性心肌病(diabetic cardiomyopathy，DCM)是糖尿病病人致殘和致死的主要原因之一，主要的病理改變是心肌組織纖維化。現代中醫認為DCM主要的病機為痰濁、氣滯、血瘀引起的心脈受損、血瘀絡阻，瓜蔞為化痰類中藥的重要成分。本研究采用鏈脲佐菌素(streptozotocin，STZ)誘導小鼠糖尿病模型，觀察瓜蔞皮注射液對糖尿病心肌纖維化的治療作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 健康8周齡C57BL/6J小鼠，Ⅱ級，雄性，體重(22±2)g，購自上海南方模式生物研究中心。

1.2 藥物和試劑 瓜蔞皮注射液(上海第一生化制藥廠，4 g/mL)，STZ(美國SIGMA-ALDRICH)，檸檬酸，檸檬酸二鈉，甲苯胺藍(美國AMRESCO公司)。

1.3 儀器 羅氏樂康全血糖儀、小動物高分辨率超聲(Vevo770)。

1.4 實驗方法

1.4.1 STZ誘導糖尿病小鼠模型的制備 實驗動物禁食不禁水12 h，腹腔注射STZ (臨用前用0．1 mol/L、pH 4．5的檸檬酸緩沖液配成1%STZ溶液，過濾除菌)50 mg/kg，每天1次，連續5 d；連續2 d測量血糖≥250 mg/dL認定為模型成功。

1.4.2 分組及給藥 24只實驗動物進行編號(斷指法)，抽簽法隨機分為4組，即正常對照組、STZ組、STZ+低劑量瓜蔞組、STZ+高劑量瓜蔞組，每組6只。第1天～第5天為STZ誘導期，第6天～第19天為觀察期，其后10周為藥物干預期。低、高劑量瓜蔞組小鼠在藥物干預期分別給予腹腔注射瓜蔞皮注射液2 mL/(kg·d)或4 mL/(kg·d)。

1.5 檢測指標

1.5.1 體重、血糖和心功能的測定 每2周測小鼠體重1次。采取斷尾取血法測定小鼠隨機血糖。小鼠異氟烷吸入麻醉，調節吸入氣體的流量，控制心率在400次/min～500次/min，使用小動物專用高頻超聲探頭選取心前區典型二維切面進行圖像采集和數據分析。

1.5.2 組織病理學觀察 天狼猩紅染色計算左室膠原容積分數(collagen volume fraction，CVF)評價心肌纖維化程度，心肌免疫組織化學染色檢測α-平滑肌肌動蛋白(alpha-smooth muscle actin，α-SMA)、轉化生長因子β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)蛋白的表達，甲苯胺藍染色鑒別肥大細胞。

2 結 果

2.1 STZ腹腔注射誘導形成糖尿病小鼠模型 糖尿病組小鼠隨機血糖從STZ注射結束后第2天開始升高，第12天達到峰值，并保持穩定，組間比較差異有統計學意義(P=0.03，t=2.567)。詳見圖1。

注：與正常對照組比較，*P<0.05。

2.2 瓜蔞皮注射液對小鼠體重和血糖的影響 正常對照組體重無明顯改變，其他各組小鼠的體重進行性下降，差異有統計學意義(P<0.05)，瓜蔞皮注射液對體重無影響。各模型組小鼠的血糖明顯高于正常對照組(P<0.05)。兩個劑量瓜蔞組血糖低于STZ組(P<0.05)。STZ+高劑量瓜蔞組血糖低于STZ+低劑量瓜蔞組，但差異無統計學意義(P>0.05)。說明瓜蔞皮注射液可輕度降低小鼠血糖。

2.3 瓜蔞皮注射液對STZ誘導糖尿病小鼠心功能的影響 心臟超聲結果顯示，正常對照組、STZ組、STZ+高劑量瓜蔞組小鼠左室結構和收縮功能各指標比較差異無統計學意義(P>0.05)。

2.4 瓜蔞皮注射液對STZ誘導糖尿病小鼠心肌纖維化的影響 正常對照組、STZ組、STZ+低劑量瓜蔞組和STZ+高劑量瓜蔞組左室CVF分別為(1.40±0.35)%、(9.06±0.81)%、(6.26±0.11)%、(4.82±0.91)%；α-SMA免疫組織化學染色IOD值分別為3027.43±938.13、17081.65±1360.72、9853.07±824.51、5 974.71±927.67，各組比較差異有統計學意義(P<0.001)；TGF-β1蛋白表達趨勢與α-SMA一致，IOD值分別為9927.72±1673.18、66495.50±2 386.65、51 217.57±3 769.32、19 982.48±1 426.54，其他各組與對照組比較差異有統計學意義(P<0.001)。說明瓜蔞皮注射液對糖尿病心肌纖維化有預防和治療作用。詳見圖2～圖4。

注： 與正常對照組比較，***P<0.001；與STZ組比較，*P<0.05，#P<0.001。

1組小鼠心肌纖維化程度(400×)

注：A代表正常對照組；B代表STZ組；C代表STZ+高劑量瓜蔞組。與正常對照組比較，* P<0.05，***P<0.001；與STZ組比較，#P<0.001；與STZ+低劑量瓜蔞組比較，△P<0.001。

圖3 免疫組織化學染色觀察心室肌α-SMA的表達(400×)

注：A代表正常對照組；B代表STZ組；C代表高劑量瓜蔞組。與正常對照組比較， ***P<0.001；與STZ組比較，*P<0.001；與STZ+低劑量瓜蔞組比較，△P<0.001。

圖4 免疫組織化學染色觀察心室肌TGF-β1的表達(400×)

2.5 瓜蔞皮注射液對STZ誘導糖尿病小鼠心肌肥大細胞數目的影響 心肌組織中肥大細胞多分部在心外膜下和血管周圍。正常對照組小鼠心肌中肥大細胞數目較少，細胞體積較小，顆粒含量少。其他各組肥大細胞數目明顯增加，體積較大，顆粒含量多，但應用瓜蔞治療后，肥大細胞數目較STZ組減少，差異有統計學意義(P<0.05)。詳見圖6。

注：圖中黑色箭頭所指為心肌肥大細胞；與正常對照組比較，

***P<0.001；與STZ組比較，* P<0.05，#P<0.001。

圖5 甲苯胺藍染色顯示心肌組織肥大細胞(400×)

3 討 論

目前研究認為多次小劑量腹腔注射STZ誘導的糖尿病動物模型是1型糖尿病模型[3]。本研究中C57BL/6J小鼠腹腔注射STZ，血糖升高且保持穩定，可以成功誘導糖尿病小鼠模型。該結果與既往文獻報道一致[4]。糖尿病小鼠成模12周心臟超聲結果與正常對照組相比差異無統計學意義。而有研究結果顯示左室射血分數(LVEF)及左室壁厚度降低[2-4]。出現這種差異的可能原因有：本研究觀察的時間尚短；再者應進一步測量舒張功能相關的指標，如E’/A'、左心室內壓最大下降速率(-dp/dtmax)等，因為糖尿病性心肌病的早期病理生理改變為左室舒張功能的減退。

心肌纖維化是發生DCM的重要病理機制[5]。心肌纖維化導致左室壁僵硬且順應性降低，導致收縮和舒張功能障礙[6]。本研究結果顯示，STZ誘導糖尿病小鼠在成模12周時心肌組織纖維化明顯，具體表現在TGF-β等促進纖維化的指標明顯升高，α-SMA蛋白表達增加，提示由成纖維細胞向肌成纖維細胞的分化增加，天狼猩紅染色確定心肌組織膠原沉積。該結果與現有結果一致[4，7]。

DCM在傳統醫學中屬于消渴、心悸和胸痹范疇。瓜蔞皮是祛痰之要藥，具有寬胸、理氣、散結、化痰之功效。史國玉等[8]分析瓜蔞皮藥材的HPLC指紋圖譜，確認的成分有香草酸、異槲皮苷、香草酸葡萄糖苷、蘆丁和柯伊利素葡糖糖苷。現有研究顯示其能抑制心肌成纖維細胞增殖及膠原合成，具有抗纖維化的作用[9]。本研究選用瓜蔞皮注射液為研究藥物，結果顯示其對糖尿病小鼠的體重無改變，可輕度降低血糖，降低心肌肥大細胞數目，使α-SMA和TNF-β1的蛋白表達下降，CVF降低。結果顯示其可以抑制肥大細胞的激活、抑制糖尿病心肌纖維化。其他研究也證實以瓜蔞為主要成分的瓜蔞薤白半夏湯能降低肺組織TNF-β1的表達，減輕平陽霉素所致的大鼠肺纖維化[10]。

肥大細胞廣泛參與急性心肌梗死、高血壓、動靜脈漏等病理情況下的心臟重構和心肌纖維化，并在其中起到關鍵作用[11]。既往的研究顯示，應用肥大細胞膜穩定劑可以明顯的改善糖尿病心肌纖維化[12]。在本研究中，糖尿病組小鼠心肌肥大細胞浸潤數目明顯增加，應用瓜蔞皮注射液后肥大細胞數目降低。瓜蔞皮注射液改善糖尿病心肌纖維化的可能機制為抑制肥大細胞在心肌組織中的浸潤和激活。

[1] International Diabetes Federation. IDF Diabetes Atlas 2014 Update[Z]. Available from：URL：http：//www.idf.org/diabetesatlas.

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[3] Like AA，Rossini AA．Streptozotocin-induced pancreatic insulitic：new model of diabetes mellitus[J].Science，1976，193(4251)：415-417．

[4] Chenyong Q， Thomas CM，Seqqat R，et al. Angiotensin type 1a receptor-deficient mice develop diabetes-induced cardiac dysfunction， which is prevented by renin-angiotensin system inhibitors[J].Cardiovascular Diabetology，2013，12：169-182.

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[6] Asbun J，Villarreal FJ. The pathogenesis of myocardial fibrosis in the setting of diabetic cardiomyopathy[J]. J Am Coll Cardiol，2006，47(4)：693-700.

[7] Chunjun L，Lin L， Hui L， et al. Cardiac fibrosis and dysfunction in experimental diabetic cardiomyopathy are ameliorated by alpha-lipoic acid[J]. Cardiovascular Diabetology，2012，11：73.

[8] 史國玉，劉偉，耿巖玲，等.瓜蔞皮藥材的HPLC指紋圖譜[J].中國實驗方劑學雜志，2014，20(1)：73-76.

[9] 沈雁，韋紅．瓜萎薤白半夏湯對心肌纖維化中整合素β1的抑制作用[J]．現代藥物與臨床，2010，25(4)：277-281．

[10] 宋建平，李瑞琴，李偉，等.瓜蔞薤白湯對肺纖維化大鼠肺組織中轉化生長因子β1表達的影響[J].北京中醫藥大學學報，2005，28(2)：40-43.

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[12] Zhigang H，Qun J，Min F，et al.Myocardial remodeling in diabetic cardiomyopathy associated with cardiac mast cell activation[J].PLoS One，2013，8(3)：e60827-e60835.

(本文編輯郭懷印)

Therapeutic Effect of Trichosanthes Fruit Extract on Myocardial Fibrosis in Streptozotocin Induced Diabetic Mice

Li Na，Huang Zhigang，Liang Chun，Yue Wenheng，Wu Zonggui

Changzheng Hospital，Second Military Medical University，Shanghai 200003，China Corresponding Author：Wu Zonggui

Objective To observe the therapeutic effect of extract of trichosanthes fruit extract(TFE) on myocardial fibrosis in streptozotocin(STZ) induced diabetic mice.Methods Diabetic model was induced by STZ in C57BL / 6J mice.Gualoupi injection was used as the study drug.The mice were randomly assigned to normal control group，STZ group，STZ + low dose TFE group，and STZ + high dose TFE group.Body weight，random blood glucose，cardiac function，left ventricular collagen volume fraction，mast cell number inmyocardium were observed.The expression of α-smooth muscle actin(α-SMA)and transforming growth factor beta 1(TGF-beta 1) in myocardium were tested by immunohistochemical staining.Results Mice in STZ group showed declined body weight，hyperglycemia，more mast cell infiltration in myocardium，increased left ventricular collagen volume fraction and elevated expression of α-SMA and TGF-beta 1.Mice in treating group had less mast cell infiltration，lower left ventricular collagen volume fraction and reduced expression of α-SMA and TGF-beta 1.Results in high dose TFE group was better than that in low dose TFE group.Conclusion Gualoupi injection can improve cardiac fibrosis in STZ induced diabetic mice.The possibly mechanism is inhibiting the infiltration and activation of mast cells in myocardial tissue.

diabetic cardiomyopathy；myocardial fibrosis；trichosanthes fruit extract；mast cells；α-smooth muscle actin；transforming growth factor beta 1

國家自然科學基金面上項目(No.81473445)；國家自然科學基金青年基金(No.81303111)

第二軍醫大學附屬長征醫院(上海 200003)

吳宗貴，E-mail：zgwu@medmail.com

R587.1 R255.4

A

10．3969/j．issn．1672-1349．2016．04．006

1672-1349(2016)04-0355-03

2015-10-11)