姜黃素對裸鼠人胃癌細胞MMP-2和CD44v6在mRNA水平表達的影響

魏世平　張俊會

姜黃素對裸鼠人胃癌細胞MMP-2和CD44v6在mRNA水平表達的影響

魏世平張俊會

【摘要】目的觀察姜黃素對胃癌組織中MMP-2和CD44v6在mRNA水平表達的影響，探討其抑制胃癌細胞轉移的作用機制。方法以SGC-7901胃癌細胞株建立胃癌裸鼠原位移植瘤模型，將裸鼠隨機分為對照組及姜黃素組，每組12只。觀察裸小鼠胃癌種植后腫瘤生長及轉移灶情況，用原位雜交方法檢測腫瘤組織中MMP-2mRNA和CD44v6mRNA表達的變化。結果所有荷瘤鼠胃壁均有腫瘤生長，荷瘤率100%，姜黃素組肝、腹腔和淋巴結的轉移比對照組明顯減少(P＜0.05);姜黃素治療組瘤體中MMP-2mRNA和CD44v6mRNA的表達明顯下調(P＜0.05)。結論姜黃素具有抑制人胃癌裸鼠原位移植瘤轉移的作用，其作用機制可能與下調MMP-2mRNA和CD44v6mRNA的表達有關。

【關鍵詞】姜黃素;胃癌;mmP-2; CD44v6

【中圖分類號】R 735.2

【文獻標識碼】A

【文章編號】1002－7386(2015)16－2412－04

doi:10.3969/j.issn.1002－7386.2015.16.003

【Abstract】Objective To investigate the effects of curcumin on the expression ofmmP-2mRNA and CD44v6mRNA in human gastric cells，and to explore the possible actionmechanisms of curcumin in inhibitingmetastasis of gastric cancer.Methods The orthotopic transplantation tumormodels were established in nudemice with SGC-7901 gastric cancer cell line，then the nudemice were randomly divided into control group and curcumin group，with 12mice in each group.The tumor growth andmetastasis condition were observed，and the expression levels ofmmP-2mRNA and CD44v6mRNA in tumor tissue were detected by in situ hybridization.Results The successful rate of orthotopic transplantation tumor was 100%.Themetastases of liver，peritoneal cavity and lymph node in curcumin group were significantly less than those in control group(P＜0.05)，moreover，the expression levels ofmmP-2mRNA and CD44v6mRNA in curcumin group were significantly down-regulated，as compared with those in control group(P＜0.05).Conclusion Curcumin can inhibit gastric cancermetastasis in nudemice orthotopic transplantation tumor，and its actionmechanismmight be related to down-regulation of the expression levels ofmmP-2mRNA and CD44v6mRNA.

收稿日期:(2015－02－06)

作者單位: 054000河北省邢臺市，邢臺醫學高等專科學校病理教研室

Influence of curcumin on the expression ofmmP-2mRNA and CD44v6mRNA in human gastric cancer cells in nudemicemodel

WEI Shiping，ZHANG Junhui.Xingtaimedical College，Hebei，Xingtai 054000，China

【Key words】curcumin; gastric cancer;mmP-2; CD44v6

胃癌是常見的消化道惡性腫瘤，在我國，每年死于胃癌患者達16萬人，占全部惡性腫瘤死亡人數的23%。胃癌的發生、發展是多因素、多階段、多基因變異所致的癌變過程。胃癌的單純手術切除，可獲治愈的僅限早期胃癌且不伴有任何轉移灶者，有轉移灶的早期胃癌及全部進展期胃癌，內科治療占有重要地位。姜黃素是從植物姜黃的根莖中提取的主要有效成分，大量研究表明，姜黃素具有抗氧化、抗炎和抗腫瘤活性［1］。在腫瘤的發生發展過程中，姜黃素通過多種通路和靶點相互作用，發揮抗腫瘤作用［2］。但其抗腫瘤機制較為復雜，至今仍未完全闡明。為此本研究通過建立胃癌模型，進一步探討姜黃素抑制胃癌細胞轉移的作用機制。

1　材料與方法

1.1材料4～6周齡BALB/C nu/nu裸鼠24只，雄性，體重18～21 g，購自上海斯萊克實驗動物有限公司，SPF級條件下飼養，合格證號: SCXK(滬)2007-0003。人胃癌細胞株SGC-7901購自中國科學院上海細胞生物研究所;姜黃素為Sigma公司產品。原位雜交試劑盒購自武漢博士德生物技術有限公司;醫用吻合型OB膠購自廣州白云醫用膠有限公司。

1.2方法

1.2.1裸鼠人胃癌SGC-7901原位移植模型的建立:參照許玲等［3］的方法建立裸鼠人胃癌原位移植模型，選擇鼠齡為4～6周的SCID裸鼠，將人胃癌細胞株SGC-7901接種于裸鼠腋部皮下，當皮下瘤體長至0.8 ～1.0 cm左右時，在無菌條件下將瘤組織剔除纖維包膜及出血壞死部分，剝取出來，并將瘤組織小心切成直徑1.5mm左右的組織塊，轉種至其他裸鼠皮下，每只

裸鼠移植1個瘤塊，如此反復進行鼠間傳代，該實驗的原位移植材料是第六代裸鼠的皮下移植瘤。處死傳代瘤裸鼠，將腫瘤組織從裸鼠腋部皮下剝取，切開選取生長良好的，淡紅色、魚肉狀的瘤組織備用。實驗動物進行腹腔麻醉，選擇左側正中旁切口打開腹部，用無菌注射器針頭在胃大彎處近胃竇旁劃破胃壁漿膜層，將腫瘤組織植入，將1滴醫用OB生物膠滴在瘤塊表面滴上，覆蓋瘤組織表面，待生物膠凝固后在進行縫合關腹。

1.2.2動物分組及給藥:移植裸鼠隨機分為對照組和姜黃素組，每組12只，于造模后第1天開始給藥，姜黃素組給予姜黃素200mg/kg，0.2ml/次，隔日腹腔注射1次，對照組給予同等劑量的0.9%氯化鈉溶液。在造模9周后將裸鼠處死。

1.2.3觀察轉移灶:處死動物后，觀察腹腔、肝臟及淋巴結的腫瘤轉移情況。根據轉移部位的不同進行評分［4］，肝臟轉移者為2分，腹腔及淋巴結轉移者均為1分，無轉移者為0分，比較各組評分，并進行相關的統計學處理。

1.2.4原位雜交法檢測胃癌組織MMP-2mRNA和CD44v6mRNA的表達，實驗操作步驟按說明書進行，DAB顯色蘇木素復染。陽性判斷標準:mmP-2mRNA(圖1)及CD44v6mRNA(圖2)表達于細胞漿，以棕黃色顆粒為陽性表達。用半定量積分法判斷結果，即對每個點的陽性細胞著色強度及陽性細胞率分別進行分級記分，然后根據兩項之和確定其陽性強度。胞漿含棕黃色顆粒者為陽性。陽性著色強度:無色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分;陽性著色細胞數:每張切片上觀察5個高倍視野(×200)，計數陽性細胞百分比，陽性細胞數≤10%為1分，11%～50%為2分，51%～100%為3分。將著色強度與陽性細胞百分比分值相加，0～2分為陰性(－)，3分為弱陽性(+)，4分為輕度陽性(++)，5～6分為(+++)。

1.3統計學分析應用SPSS 10.0統計軟件，計量資料以±s表示采用t檢驗，計數資料采用χ2檢驗，P ＜0.05為差異有統計學意義。

2　結果

2.1姜黃素對胃癌轉移的影響實驗結束后處死裸鼠，觀察原位移植瘤生長情況良好，24只裸鼠的胃壁均可見腫瘤的生長和浸潤，姜黃素組肝、腹腔和淋巴結轉移比0.9%氯化鈉溶液對照組明顯減少(P＜0.05)。見表1。

2.2姜黃素對裸鼠原位移植瘤MMP-2mRNA及CD44v6mRNA表達的影響MMP-2mRNA及CD44v6mRNA主要表達于腫瘤細胞的胞漿內，呈淺黃色至棕褐色。MMP-2mRNA在姜黃素治療組陽性表達率為25%，對照組陽性表達率為75%，組間差異有統計學意義(P＜0.05); CD44v6mRNA在姜黃素治療組僅有33.3%的陽性表達率，而在對照組陽性表達率則高達83.3%，組間差異有統計學意義(P＜0.05)。見表2，圖1～4。

表1　2組裸鼠原位移植瘤轉移情況比較　n =12

表2　姜黃素對裸鼠原位移植瘤MMP-2mRNA及CD44v6mRNA表達的影響　n =12，只

圖1　2組胃癌細胞MMP-2mRNA的表達情況

圖2　2組胃癌細胞CD44v6mRNA的表達情況

3　討論

姜黃素是一種植物多酚，提取自姜黃科植物的根莖中，它不僅可應用于食物及作料等日常生活，而且還可以應用于抗炎、抗凝、抗動脈粥樣硬化等，與此同時也可以應用于抗腫瘤，它的抗癌作用的機制復雜［5］，目前普遍認為其抗腫瘤機制與誘導腫瘤細胞凋亡有關，在一定程度上還能夠抑制腫瘤細胞的產生、生長和轉移，并且還具有腫瘤耐藥逆轉劑的功能，目前是美國所承認的一種預防腫瘤的藥物。常宏宇等［6］發現姜

黃素可以增強抗腫瘤藥物的藥效、降低腫瘤細胞的耐藥性。何靜等［7］實驗證實姜黃素可以抑制血管內皮生長因子表達的，降低腫瘤的侵襲性。Zhang等［8］研究證實姜黃素可以抑制核因子κB的活性，下調增殖相關基因、凋亡相關基因及血管生成素相關的表達，抑制腫瘤細胞的生長。

MMPs是結構高度同源的基質金屬蛋白酶家族成員之一，是人體內降解IV型膠原和細胞外基質的主要酶，包括20多個成員，腫瘤細胞以旁分泌的形式刺激MMPs的合成［9，10］，9、10MMPs蛋白表達是預后不良的生物學標志，MMP-2是MMPs家族中重要的一員［11］，MMP-2可通過破壞局部組織結構、基底膜屏障以及促進腫瘤新生血管形成等作用，而在腫瘤的生長、浸潤和轉移中發揮重要作用［12］。有研究說胃癌中MMP2高表達在血管、淋巴管及淋巴結轉移灶的癌栓中，說明MMP2與胃癌的浸潤和侵襲有關，可以作為一個指標評價患者預后［13］

研究證實許多惡性腫瘤的侵襲和轉移過程中均有MMP-2的過度表達［14，15］。本研究中我們采用原位雜交技術對腫瘤組織中MMP-2mRNA的表達進行檢測，研究發現MMP-2mRNA在對照組腫瘤組織內陽性表達率為75%，姜黃素組腫瘤內MMP-2mRNA的表達顯著低于生理鹽水對照組。

CD44是一種分布極為廣泛的細胞膜表面跨膜糖蛋白，屬于粘附分子，是透明質酸的受體，主要參與細胞間、細胞與基質之間的特異性粘連過程。它可以直接影響到腫瘤細胞與細胞外基質的結合能力，刺激新生血管的生成，進而影響腫瘤的形成、浸潤、侵襲和轉移［16］，CD44v6是CD44的一種拼接變構體，是一種與腫瘤轉移相關的基因，主要在病理過程中出現，其有助于腫瘤細胞獲得轉移潛能，其在腫瘤組織中呈現高表達，而在腫瘤發生器官的正常組織中低表達或不表達。

近年研究發現CD44的高表達與多種人體惡性腫瘤的發生發展和侵襲轉移有關。臨床研究報道，在乳腺癌、口腔癌、前列腺癌、結直腸癌、肝癌、胰腺癌、肺癌和腎細胞癌等［17－19］惡性腫瘤中CD44蛋白陽性癌細胞的侵襲轉移能力比陰性的更強。CD44蛋白的陽性表達在癌細胞的發生發展及腫瘤的侵襲轉移方面起到重要的作用。癌細胞的侵襲轉移中CD44蛋白使得腫瘤細胞同質型黏附作用減弱，從同質黏附的原發灶脫離容易，也可以使腫瘤細胞的異質型黏附作用增強，借助黏附而移動和轉移。

實驗中我們對裸鼠胃癌組織中CD44v6mRNA的表達進行檢測，姜黃素組的腫瘤內CD44v6mRNA的表達顯著低于生理鹽水對照組，表明姜黃素能明顯抑制胃癌細胞的CD44v6mRNA的表達。

為了探討姜黃素抑制胃癌細胞轉移的機制，本研究中我們通過建立裸鼠胃癌模型，觀察姜黃素對胃癌轉移的影響，結果表明，裸鼠胃癌組織中MMP-2mRNA及CD44v6mRNA的表達顯著低于生理鹽水對照組，而且姜黃素組胃癌的肝、腹腔和淋巴結轉移明顯少于對照組。綜上所述，我們認為姜黃素可以抑制裸鼠胃癌細胞的轉移，其抑制胃癌轉移的機制可能與通過下調胃癌細胞的MMP-2mRNA及CD44v6mRNA表達相關。

參考文獻

1 Sharma RA，Gescher AJ，Steward WP.Curcumin: The story so far.Eur J Cancer，2005，41:1955-1968.

2 Anand P，Sundaram C，Jhurani S，et al.Curcumin and cancer An“oldage”disease with an“alge-old”solution.Cancer Lett，2008，267: 133-164.

3許玲，陳亞琳，蘇曉妹，等.裸鼠人胃腺癌SGC-7901原位移植模型的構建及其生物學特性.腫瘤防治雜志，2003，10:476-478.

4 mori T，Fujiwara Y，Yanom，et al.Prevention of peritonealmetastasis of human gastric cancer cells in nudemice by S-1，a novel oral derivative of 5-Fluorouracil.Oncology，2003，64:176-182.

5 Cheng CY，Lin YH，Su CC.Curcumin inhibits the proliferation of human hepatocellular carcinoma J5 cells by inducing endoplasmic reticulum stress andmitochondrial dysfunction.Int Jmolmed，2010，26:673-678.

6常宏宇，潘凱麗，李琦，等.姜黃素對K562/A02細胞上P-gp的表達及其功能的影響.細胞與分子免疫學雜志，2005，21:240-242.

7何靜，劉安文，蔡靖，等.姜黃素對乳腺癌細胞VEGF-C表達及增殖、侵襲性的響.腫瘤防治研究，2011，38:1109-1112.

8 Zhang C，Li B，Zhang X，et al.Curcumin Selectively Induces Apoptosis in Cutaneous T-Cell Lymphoma Cell Lines and Patients’PBMCs: Potential Role for STAT-3 and NF-κB Signaling.Journal of Investigative Dermatology，2010，130: 2110-2119.

9 Nabeshima K，Iwasaki H，Koga K，et al.Emmprin(basigin /CD147):matrixmetalloproteinasemodulator andmultifunctional cell recognitionmolecule that plays a critical role in cancer progression.Pathol Int，2006，56:359-367.

10 Cozzi PJ，Wang J，DelpradoW，et al.MUC1，MUC2，MUC4，MUC5AC andmUC6 expression in the progression of prostate cancer.Clin ExpMetastasis，2005，22:565-573.

11 ChengmF，Tzao C，Tsai WC，et al.Expression ofEMMPRIN andmatriptase in esophageal squamous cell carcinoma: correlation with clinicopathologicalparameters.DisEsophagus，2006，19:482-486.

12 Leinonen T，Pirinen R，Bohm J，et al.Increased expression ofmatrixmetalloproteinase-2(MMP-2)predicts tumour recurrence and unfavourable outcome in non-small cell lung cancer.Histol Histopathol，2008，23:693.

13 Feng G，Tan Y.Expression and significance ofmmP2 and type IV collagen in gastric cancer.Zhonghua Wai Ke Za Zhi，2000，38:775-776.

14 Samantaray S，Sharma R，Chattopadhyaya TK，et al.Increased expression ofMMP2 andMMP9 in esophageal squamous cell carcinoma.J Cancer Res Clin Oncol，2004，130:37.

15 Xie TX，Wei D，Lium，et al.Stat3 activation regulates the expression ofmatrixmetallo proteinase-2 and tumor invasion andmetastasis.Oncogene，2004，23:3550.

16 Sum IY，Yama SH，Ita Y，et al.Expression of CD44，vascular endothelial growth factor，and proliferating cell nuclear antigen in severe ve-

nous invasional colorectal cancer and its relationship to livermetastasis.Surg Today，2000，30:323-327.

17 Lm SD，Young AN，Paner GP，et al.Prognostic role of CD44 cell adhesionmolecule expression in primary andmetastatic renal cell carcinoma a clinicopathologic study of 125 cases.Virchows Arch，2008，452: 49-55.

18 Kosunen A，Pirinen R，Ropponen K，et al.CD44 expression and its relationship withmmP-9，clinicopathological factors and survival in oral squamous cell carcinoma.Oral Onco，2007，43:51-59.

19 DachmE，Charchanti A，Brasoulis E，et al.Immunohisto chemical expression of extracellu larmatrix components tenascin，fibronectin，collagen type IV and lamin in breast cancer their prognostic value and role in tumour invasion and progression.Eur J Cancer，2002，38:2362-2370.