坐骨神經分支選擇性損傷大鼠脊髓背角γ-氨基丁酸能神經元的比例變化觀察

陳朝輝，劉虹，劉洋

(1 川北醫學院附屬醫院,四川南充 637000;2遂寧市中心醫院)

?

坐骨神經分支選擇性損傷大鼠脊髓背角γ-氨基丁酸能神經元的比例變化觀察

陳朝輝1，劉虹2，劉洋1

(1 川北醫學院附屬醫院,四川南充 637000;2遂寧市中心醫院)

摘要：目的觀察坐骨神經分支選擇性損傷(SNI)模型大鼠脊髓背角γ-氨基丁酸(GABA)能神經元比例的變化。方法健康雄性SD大鼠36只，隨機分為SNI組(S組)和假手術組(D組)，各18只。S組暴露左側坐骨神經主干及三個分支，結扎切斷脛神經和腓總神經，保留腓腸神經。D組僅暴露左側坐骨神經主干及其分支，不行結扎。術前1天和術后7、14、28天分別進行大鼠左后爪內外側機械痛閾測試。造模后7、14、28天兩組大鼠分批取材(n=6)行4%多聚甲醛心臟灌注，取腰脊髓段(L5)制備石蠟切片，免疫組化染色定位GABA能神經元，并運用體視學形態定量分析兩組大鼠脊髓背角GABA能神經元比例。結果S組大鼠術后7、14、28天左側脊髓背角GABA能陽性神經元比例分別為60.41%±8.49%、55.27%±6.80%、61.87%±8.12%，右側脊髓背角GABA能陽性神經元比例分別為61.94%±11.04%、64.68%±9.77%、62.58%±4.25%，D組大鼠術后7、14、28天左側脊髓背角GABA能陽性神經元比例分別為61.27%±8.73%、63.59%±5.97%、62.81%±10.26%，右側脊髓背角GABA能陽性神經元比例分別為58.02%±4.58%、60.84%±8.28%、63.74%±10.88%，S組術后14天左側GABA能神經元比例較同組右側、D組左側低，P均<0.05。結論 SNI模型大鼠神經損傷側脊髓背角GABA能神經元比例降低，但這種改變并不持久，GABA能神經元的轉化可能與SNI大鼠機械性痛敏有關。

關鍵詞：神經病理性疼痛；機械性痛閾；GABA能神經元；脊髓背角；體視學

神經病理性疼痛是神經系統損傷引起的一種難以治療的慢性痛狀態，其發病機制不明，治療效果欠佳。坐骨神經分支選擇性損傷(SNI)模型是神經病理性疼痛的常用模型，具有神經損傷程度固定、可重復性好、產生的行為學持久、能夠提供接近模擬臨床神經病理性疼痛的許多特征等特點[1]。有研究[2]表明，脊髓背角Ⅰ～Ⅲ板層γ-氨基丁酸(GABG)能神經元等抑制性中間神經元與神經病理性疼痛密切相關，但詳細機制尚不明確。脊髓背角GABA能神經元在神經病理性疼痛發生過程中的變化和作用仍存在爭議[3～5]。因此，本實驗采用體視學的方法分析SNI大鼠脊髓背角GABA能神經元比例的變化，探討神經病理性疼痛的機制。

1材料與方法

1.1實驗動物與分組36只清潔級成年健康雄性SD大鼠，體質量260～310 g，由川北醫學院動物實驗中心提供,隨機分為假手術組(D組)和SNI組(S組)，各18只。

1.2主要試劑和儀器 GABA多克隆抗體購自英國Abcam公司，免疫組化筆購自日本CIRISC公司，SABC免疫組化染色試劑盒、DAB顯色試劑盒均購自武漢博士德生物有限公司；德國Leica切片機；意大利動態足底觸覺儀(Ugo Basile公司)；日本培養倒立顯微鏡(TS100-F，Nikon公司)；丹麥Visopharm體視學圖像系統。

1.3SNI模型制備腹腔注射3%戊巴比妥鈉按(50 mg/kg)麻醉兩組大鼠，S組大鼠麻醉后，俯臥固定于鼠板上，手術部位剪毛暴露皮膚，常規碘伏消毒鋪巾，充分暴露并分離左側坐骨神經三個分支(脛神經、腓總神經、腓腸神經)，用3-0醫用真絲編織線結扎脛神經和腓總神經，并在結扎遠端切斷，保留完整腓腸神經，然后分層縫合肌肉和皮膚，縫合前在傷口處以30萬單位/kg涂抹青霉素粉劑，并在右后腿肌注5萬單位青霉素預防術后感染。D組大鼠麻醉后僅分離暴露三個分支后不做任何處理，分層縫合肌肉和皮膚，涂抹、肌注青霉素預防感染。

1.4大鼠一般行為學觀察兩組大鼠在實驗造模前和取材前均測量體質量，作為評價其健康狀況和生長情況的指標，同時記錄各組大鼠術后一般情況。實驗過程中，將大鼠放在動態足底觸覺儀的長方形透明盒內，觀察各組大鼠的活動狀態、行走步態和后爪形態有無改變,并對大鼠的行為學情況[1級：活動狀態正常，后爪無畸形；2級：活動狀態正常，有明顯后爪畸形(攣縮)；3級：輕度活動異常，有垂足現象；4級：嚴重活動異常，術側后腿癱瘓]進行評估。

1.5大鼠機械性痛閾測試兩組大鼠均在術前1天和術后7、14、28天采用動態足底觸覺儀測量左后爪內側面(隱神經區域)和外側面(腓腸神經區域)的機械痛閾，以術前1天的測定值作為基礎值，測定時間均為下午2點到4點。

1.6大鼠脊髓背角GABA能陽性神經元定位手術操作后7、14、28天，S組和D組分批取材(n=6)，腹腔注射3%戊巴比妥鈉(50 mg/kg)麻醉,200 mL生理鹽水行心臟灌注，繼以4%多聚甲醛固定液先快后慢灌注固定約300 mL,固定后取腰段L5脊髓組織,逐級乙醇脫水,二甲苯透明,石蠟包埋切片。常規脫蠟至水后，3% H2O2孵育10 min，經熱抗原修復，5% BSA封閉液封閉20 min，滴加GABA多克隆抗體(1∶500)孵育(4 ℃)過夜。接著依次用生物素標記的羊抗鼠兔IgG孵育(37 ℃)20 min，0.01 mol/L的PBS漂洗3次，每次3 min后，滴加試劑辣根酶標記鏈酶卵白素(SABC)1～2滴，37 ℃孵育20 min，0.01 mol/L的PBS漂洗4次，每次5 min，最后在室溫下用DAB顯色5 min，蘇木精復染2 min，0.5%鹽酸乙醇分色,常規脫水、透明、中性樹膠封片。

1.7大鼠脊髓背角GABA能陽性神經元比例觀察取兩組大鼠上述各時間點免疫組化染色效果較好的切片，采用Visopharm體視學圖像系統及Olympus BX51型光學顯微鏡系統觀察。每張切片中用Layer Drawing分別勾畫出左側與右側脊髓背角，10倍物鏡下疊加10×10個點，點面積24 020.99 μm2，統計所勾畫范圍內的點的個數(N)，然后在100倍物鏡下疊加2個光學體視框，每個框左上角作為測點，框面積為55.00 μm×41.41 μm=2 211.6 μm2，設置抽樣分數為7%，從切片表面下1 μm深度開始調節焦距，計數5 μm深度有效體視框內聚焦清晰的細胞數量。GABA能陽性與陰性神經元判斷標準：陽性神經元細胞核大而圓，核仁明顯，胞質內GABA遞質著色呈棕黃色或黃褐色；陰性神經元細胞核大而圓，核仁明顯，胞質不著色。每張切片分別按照以上方法統計GABA能陽性神經元的個數與陰性神經元的個數，估算脊髓背角手術側與非手術側的GABA能神經元數目占總神經元數目的比例。

2結果

2.1兩組一般行為學比較術前兩組大鼠體質量比較無明顯差異，術后至取材前各時點兩組大鼠體質量正常增長，兩組同時點比較差異無統計學意義。所有大鼠術前體型及步態均正常，左后爪形態正常，反應及活動能力無異常。S組大鼠術后手術側(左側)后爪出現足外翻畸形、攣縮和自發性縮足反應，其中有4只大鼠評級達到3級，其余大鼠評級均為2級。D組大鼠術后活動、步態和后爪形態與術前比較無明顯異常，評級均為1級。兩組術后一般行為學比較，P<0.05。

2.2兩組機械痛閾比較兩組大鼠左后爪內外側面機械痛閾比較見表1。

表1　 兩組大鼠左后爪內外側面機械痛閾比較±s)

注：與同組術前1天比較，*P<0.05；與對照組同時點比較，#P<0.05。

注：與同組右側比較，*P<0.05；與對照組同時點比較，#P<0.05。

2.3兩組脊髓背角GABA能陽性神經元比例比較免疫組化染色結果顯示，大鼠脊髓背角GABA能神經元大小不等，體積以中小型細胞為主，GABA遞質呈均質狀分布于神經元胞質內，包繞細胞核。兩組大鼠左右側脊髓背角GABA能陽性神經元比例結果見表2。

3討論

本研究中，S組大鼠術后出現左側后爪外翻畸形、自發性縮足反應以及機械異常性疼痛等行為學變化，且這些改變持續了整個觀察周期，而D組大鼠在整個觀察周期均沒有發現明顯異常,兩組比較差異有統計學意義。SNI大鼠后爪內外側機械痛閾術后持續下降，術后各時點與術前基礎值比較差異有統計學意義，D組大鼠后爪內外側機械痛閾術后各時點與術前基礎值比較，差異均無統計學意義，結果都與Woolf建立的SNI模型[1]一致，說明本實驗大鼠SNI模型建立成功。

本實驗結果顯示，S組大鼠術后7、14、28天左側GABA能神經元比例較右側低，但僅14天時兩側比較差異有統計學意義。S組大鼠術后7、14、28天左側GABA能神經元比例較對照組左側低，但僅第14天時兩組比較差異有統計學意義。SNI大鼠后脊髓背角術側GABA能神經元比例在4周內出現了一個下降和回升的過程，這可能是GABA能神經元發生了凋亡壞死再生的過程，也可能是GABA能神經元發生了轉化。Ibuki等[6]推測CCI大鼠1周后GABA能神經元的減少可能是因為GABA遞質合成的下調。研究[7]發現，CCI大鼠GABA神經遞質合成酶谷氨酸脫羧酶(GAD)陽性細胞數從術后3天在術側和非術側都開始減少，1周后開始回升，8周時已經超過正常值，因此推測CCI大鼠GABA能神經元內GABA遞質減少，以至于胞質內的GABA濃度低于他們研究方法中的檢測閾值，表現為原來呈GABA能陽性神經元轉化為了“陰性”，低GABA遞質水平作為刺激GABA合成酶GAD表達的正反饋調節信號，隨著GAD表達的增加，GABA能神經元內GABA遞質的合成逐漸增多，GABA能陽性神經元數量也呈現增長趨勢，顯現出一種神經元“自我修復”的狀態。Polgar等[8]研究表明，脊髓中一些甘氨酸神經元表現出GABA免疫陽性。本實驗研究中GABA能陽性神經元的數量在短期內發生了下降和回升，神經元本身再生的難度較高，我們推測，在GABA能陽性神經元減少的過程中，可能發生了神經元的轉化，即原來呈GABA甘氨酸免疫雙陽性的神經元在病理性疼痛過程中暫時轉化成了甘氨酸免疫單陽性神經元。GABA是神經系統中重要的抑制性神經遞質，在痛覺信息傳導和調節中發揮重要作用，GABA能神經元在轉化過程中由于GABA遞質的數量發生變化，功能也可能發生變化，這可能與SNI大鼠機械痛閾的下降、機械性痛敏的發生有關。

以往學者大都是采用直接鏡下計數等二維平面內統計方法，存在人為偏倚和誤差，而本實驗運用了公認的更為可靠的三維空間體視學形態定量方法[9]，通過在所測切片區域疊加適當的體視學探針，分別計數GABA能陽性神經元與陰性神經元個數，得到每張切片GABA能陽性神經元比例，用比例來作為估算GABA能陽性神經元數量改變的指標，排除了石蠟包埋前后組織體積變化的影響[10]，結果更加準確可靠。

綜上可見，SNI模型大鼠脊髓背角GABA能神經元比例降低，且這種改變并不持久,GABA能神經元的轉化可能與SNI機械性痛敏的發生有關。

參考文獻：

[1] Decosterd I, Woolf CJ. Spared nerve injury:an animal model of persistent peripheral neuropathic pain[J]. Pain， 2000,87(2):149-158.

[2] Meisner JG, Marsh AD, Marsh DR. Loss of GABAergic interneurons in laminaeⅠ-Ⅲ of the spinal cord dorsal horn contributes to reduced GABAergic tone and neuropathic pain after spinal cord injury[J]. J Neurotrauma， 2010,27(4):729-737.

[3]Yowtak J, Wang J, Kim HY, et al. Effect of antioxidant treatment on spinal GABA neurons in a neuropathic pain model in the mouse[J]. Pain, 2013,154(11):2469-2476.

[4] Polgár E, Todd AJ. Tactile allodynia can occur in the spared nerve injury model in the rat without selective loss of GABA or GABA(A)receptors from synapses in laminae Ⅰ-Ⅱ of the ipsilateral spinal dorsal horn[J]. Neuroscience, 2008,156(1):193-202.

[5] Kontinen VK, Stanfa LC, Basu A, et al. Electrophysiologic evidence for increased endogenous gabaergic but not glycinergic inhibitory tone in the rat spinal nerve ligation model of neuropathy[J]. Anesthesiology, 2001,94(2):333-339.

[6] Ibuki T, Hama AT, Wang XT, et al. Loss of GABA immunoreactivity in the spinal dorsal horn of rats with peripheral nerve injury and promotion of recovery by adrenal medullary grafts[J]. Neuroscience, 1997,76(3):845-858.

[7] Eaton MJ, Plunkett JA, Karmally S, et al. Changes in GAD- and GABA- immunoreactivity in the spinal dorsal horn after peripheral nerve injury andpromotion of recovery by lumbar transplant of immortalized serotonergic precursors[J]. J Chem Neuroanat, 1998,16(1):57-72.

[8] Polgar E, Hughes DI, Riddell JS, et al. Selective loss of spinal GABAergic or glycinergic neurons is not necessary for development of thermal hyperalgesia in the chronic constriction injury model of neuropathic pain[J]. Pain, 2003,104(1-2):229-239.

[9] West MJ. Stereological methods for estimating the total number of neurons and synapses: issues of precision and bias[J]. Trends Neurosci, 1999,22(2):51-61.

[10] 林菁艷,彭彬,楊正偉.石蠟包埋與切片染色對大鼠脊髓腰膨大體積的影響[J].重慶醫科大學學報,2010,35(12):1856-1858.

·作者·編者·讀者·

醫藥學名詞常見錯誤及正確寫法

藥品名稱：錯誤(正確)

二磷酸腺苷(腺苷二磷酸)，消炎痛(吲哚美辛)，阿斯匹林(阿司匹林)，維甲酸(維A酸)，雙磷酸鹽(雙膦酸鹽)，甲氨喋呤(甲氨蝶呤)，博萊霉素(博來霉素)，開浦蘭(左乙拉西坦)，雷公多苷(雷公藤多苷)，非那根(異丙嗪)，四乙銨(四乙胺)，洗必泰(氯已定)，美息律(美西律)，大環內脂類(大環內酯類)，川穹(川芎)，酒精(乙醇)，頭胞哌酮(頭孢哌酮)。

疾病及其相關名稱：錯誤(正確)

甲狀腺機能(甲狀腺功能)，血沉(紅細胞沉降率)，X光片(X線片)，帕金森癥(帕金森病)，食道(食管)，適應征、適應癥(適應證)，禁忌征、禁忌癥(禁忌證)，酒精肝(酒精性肝病)，心肌梗塞(心肌梗死)，腦梗塞(腦梗死)，毒副反應(不良反應)，肌肉注射(肌內注射)，心率失常(心律失常)，中風(卒中)，生理機能(生理功能)，返流(反流)，血液動力學(血流動力學)，機能(功能)，人流(人工流產)，藥動學(藥代動力學)，綠膿桿菌(銅綠假單胞菌)，機理(機制)，圍產期(圍生期)，氧和指數(氧合指數)，慢性阻塞性肺病(慢性阻塞性肺疾病)，血管緊張素轉換酶(血管緊張素轉化酶)，血管緊張肽轉換酶抑制劑(血管緊張素轉化酶抑制劑)，咳血(咯血)，心房纖顫(心房顫動)，腦溢血(腦出血)，穩定性心絞痛(穩定型心絞痛)，法樂四聯癥(法洛四聯癥)，非何杰金淋巴瘤(非霍奇金淋巴瘤)，視網膜神經膠質瘤(視網膜母細胞瘤)，剖腹產術(剖宮產術)。

其他：錯誤(正確)

粘附(黏附)，粘痰(黏痰)，粘液(黏液)，粘滯(黏滯)，粘膜(黏膜)，粘多糖(黏多糖)，多粘菌素(多黏菌素)，粘質沙雷菌(黏質沙雷菌)，層黏聯蛋白(層黏連蛋白)，機率、幾率(概率)，脫臘(脫蠟)，側枝循環(側支循環)，縱膈(縱隔)，紅血球(紅細胞)，白血球(白細胞)。

Proportion changes of GABAergic neurons in spinal dorsal horn of SNI rats

CHENZhao-hui1, LIU Hong, LIU Yang

(1AffiliatedHospitalofNorthSichuanMedicalCollege,Nanchong637000,China)

Abstract:Objective To observe the proportion changes of γ-aminobutyric acid (GABA)ergic neurons in spinal dorsal horn (SDH) of SNI (spared nerve injury) model rats.MethodsThirty-six healthy male SD rats were randomly divided into two groups: SNI group (group S, n=18) and sham operation group (group D, n=18). The left sciatic nerve trunk and three branches were exposed, two of which, known as tibial and peroneal nerve, were ligated and cut off, and the sural nerve was preserved to build the SNI model in the group S. The left sciatic nerve trunk and three branches were only exposed in the group D. On the 1st day before surgery, 7th, 14th and 28th days after surgery, the outside and inside MWTs (mechanical withdrawal threshold) of left hind paw in rats were tested. On the 7th , 14th and 28th days after surgery, rats in the two groups underwent cardiac perfusion of 4% paraformaldehyde, then the L5spinal segments were dissected to prepare paraffin sections. GABAergic neurons were labeled by immunohistochemical staining of GABA neurotransmitters in cytoplasm. The quantitative analysis of stereological morphometry was used to describe the proportions of GABAergic neurons in the two groups. ResultsThe proportions of GABAergic neurons in the left spinal dorsal horn of group S on the 7th, 14th and 28th days after surgery were 60.41%±8.49%, 55.27%±6.80% and 61.87%±8.12%, respectively, and in the right spinal dorsal horn of group S were 61.94%±11.04%, 64.68%±9.77% and 62.58%±4.25%. On the same way, the proportions of GABAergic neurons in the left spinal dorsal horn of group D on the 7th, 14th and 28th days after surgery were 61.27%±8.73%, 63.59%±5.97% and 62.81%±10.26%, respectively, and in the right spinal dorsal horn of group D were 58.02%±4.58%, 60.84%±8.28% and 63.74%±10.88%. Compared with the right SDH of the same group and left SDH of group D, there were statistically significant reductions in the proportions of GABAergic neurons of the left SDH on 14th day after SNI in the group S (all P<0.05).ConclusionSNI model may lead to the decrease of the proportions of GABAergic neurons in SDH of damaged side, but this change does not last long. The transformation of GABAergic neurons may be related to mechanical hypersensitivity

Key words:neuropathic pain; mechanical pain threshold; GABAergic neurons; spinal cord dorsal horn; stereology

收稿日期：(2015-08-12)

通信作者簡介：劉洋(1969-)，男，博士，教授，主要研究方向為神經病理性疼痛基礎與臨床。E-mail: phoenixylly@sina.com.cn

作者簡介：第一陳朝輝(1976-),男,碩士,副教授，主要研究方向為神經病理性疼痛機制。E-mail: 563504740@qq.com

基金項目：川北醫學院科研發展計劃項目(CBY12-A-ZP04)。

中圖分類號：R441.1

文獻標志碼：A

文章編號：1002-266X(2015)47-0010-04

doi：10.3969/j.issn.1002-266X.2015.47.004