加巴噴丁對糖尿病神經病理痛大鼠背根神經節FGF-2表達的影響

孫德旭，李向陽，王林，秦蘇萍

(1徐州醫學院人體解剖學教研室，江蘇徐州 221004；2 徐州醫學院病原生物學與免疫學教研室)

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加巴噴丁對糖尿病神經病理痛大鼠背根神經節FGF-2表達的影響

孫德旭1，李向陽2，王林2，秦蘇萍2

(1徐州醫學院人體解剖學教研室，江蘇徐州 221004；2 徐州醫學院病原生物學與免疫學教研室)

摘要：目的觀察加巴噴丁(GBP)對鏈脲佐菌素(STZ)誘導糖尿病神經病理性痛(DNP)大鼠背根神經節成纖維細胞生長因子2(FGF-2)蛋白表達的影響，以探討其鎮痛機制。方法將80只SD大鼠隨機分為C組、DNP組、SC+DNP組和GBP+DNP組，各20只。除C組外，其他各組采用腹腔注射STZ建立DNP模型。SC+DNP組和GBP+DNP組在造模15天開始分別腹腔注射生理鹽水、GBP(50 mg/kg)，每天1次，連續7 d。在造模前1天及造模后3、7、10、14、21、28天測定各組大鼠的縮足反射機械刺激閾值(PWMT)和縮足反射熱輻射潛伏期(PWTL)；免疫組織化學法和Western blotting法檢測大鼠背根神經節中的FGF-2。結果與C組相比，DNP組、SC+DNP組、GBP+DNP組造模后3、7、10、14、21、28天PWMT和PWTL低(P均<0.05)。與DNP組及SC+DNP組相比，GBP+DNP組造模后21天PWMT和PWTL高(P均<0.05)。造模后21天，DNP組、SC+DNP組和GBP+DNP組背根神經節內FGF-2蛋白含量較C組高，GBP+DNP組較DNP組、SC+DNP組低(P均<0.05)。結論 GBP可通過抑制DNP大鼠背根神經節內FGF-2的表達，從而減輕大鼠神經病理性痛。

關鍵詞：加巴噴丁；糖尿病神經病理性痛；背根神經節；成纖維細胞生長因子2

糖尿病神經病理性痛(DNP)是糖尿病患者常見的并發癥[1]。患者可出現自發痛、痛覺過敏、誘發觸痛和其他不典型感覺異常，嚴重影響患者的生活質量，至今尚缺乏有效的治療手段。研究[2,3]表明，活化的星形膠質細胞在神經病理性痛的發生過程中起重要作用，是維持慢性疼痛的重要因素。成纖維細胞生長因子2(FGF-2)最初在背根神經節內被發現，由初級感覺神經細胞和星形膠質細胞產生，能夠激活星形膠質細胞，從而參與疼痛信號的轉導過程，可見FGF-2與疼痛的關系非常密切。加巴噴丁(GBP)是一種常用的鎮痛藥物，是臨床上用于治療神經病理性痛的一線藥物，鎮痛療效明確[4]，但其鎮痛機制尚不明確。本實驗旨在觀察GBP對DNP大鼠痛覺行為及背根神經節FGF-2表達的影響，探討其鎮痛機理，為藥物的應用提供理論依據。

1材料與方法

1.1試劑與儀器鏈脲佐菌素(STZ，Sigma公司，美國)，GBP(Sigma公司，美國)，多聚賴氨酸(武漢博士德)，FGF-2兔多克隆抗體(一抗，武漢博士德)，二步法(非生物素)免疫組化試劑盒(PV-9001，北京中杉生物有限公司)，BCA蛋白分析試劑盒(南通碧云天生物技術公司)，血糖儀(中國歐姆龍公司)，von Frey Hairs(美國Stoeling公司)，IITC series 8型熱痛刺激儀(美國ITC公司)。

1.2實驗動物及分組成年健康雄性SD大鼠80只，體質量200～220 g，由徐州醫學院實驗動物中心提供，采用隨機數字表法，將其分為C組、DNP組、SC+DNP組和GBP+DNP組，各20只。

1.3DNP模型的制備及行為學指標檢測參照文獻[5]制備DNP模型，測定基礎痛閾后皮下注射STZ 70 mg/kg，給藥后第7天尾靜脈血糖穩定且>16.7 mmol/L為糖尿病模型制備成功，給藥后第14天痛閾降低幅度>基礎痛閾15%為DNP模型制備成功。STZ使用時溶于0.1 mol/L新鮮配制的枸櫞酸/枸櫞酸鈉緩沖液中(冰浴，pH4.5)，C組注射相同劑量的枸櫞酸/枸櫞酸鈉緩沖液。SC+DNP組和GBP+DNP組于STZ注射第15天起分別腹腔注射生理鹽水、GBP 50 mg/kg，每天1次，連續7 d，腹腔注射給予GBP方法參照文獻[6]。在造模前1天、造模后3、7、10、14、21、28天，觀察各組大鼠行為學指標，即縮足反射機械刺激閾值(PWMT)和縮足反射熱輻射潛伏期(PWTL)。PWMT、PWTL檢測參照文獻[7,8]。

1.4 FGF-2檢測方法各組大鼠在第14、21、28天分別選取6、8、6只，在4%水合氯醛40 mg/kg深度麻醉下，迅速將其斷頭處死，冰上操作取L3～L5背根神經節。①采用免疫組織化學法。取大鼠背根神經節置于4%的多聚甲醛中固定1 d，石蠟包埋，修塊后連續切片，片厚4 μm，60 ℃烘干備用。切片常規入水，經微波修復后，0.01 mol/L的PBS漂洗2 min×3次，3%的去離子水孵育10 min，PBS漂洗2 min×3次，滴加一抗FGF-2(1∶100)4 ℃過夜，PBS漂洗2 min×3次，滴加聚合物輔助劑37 ℃孵育20 min，PBS沖洗2 min×3次，滴加辣根酶標記抗兔IgG聚合物，37 ℃孵育20 min，PBS沖洗2 min×3次，應用DAB溶液顯色，自來水充分沖洗、復染、脫水、透明、封片。陰性對照用PBS代替一抗。顯微鏡觀察見棕黃色為陽性，采用Olympus顯微鏡采集圖像。②采用Western blotting法。用玻璃研磨器10倍于組織的冰裂解液將組織機械地搗碎，充分勻漿。冰上裂解30 min后用移液器將裂解液轉移至1.5 mL離心管中。提取總蛋白并根據BCA法測定樣本蛋白濃度后備用。取等量樣本加至10% SDS-PAGE凝膠恒壓電泳，縮膠電壓70 V，分離膠電壓140 V。濕轉法將蛋白轉移至PVDF膜，5%脫脂牛奶封閉1 h后加兔抗FGF-2多克隆抗體(1∶200)4 ℃孵育過夜；TBST沖洗，3×15 min，加入堿性磷酸酶標記的羊抗兔二抗(1∶1 000)，室溫搖床孵育1.5 h，用PBS洗滌后進行增強化學熒光反應，加入NBT/BCIP顯色液，待反應達到要求后，流水洗滌終止反應。所得條帶用Image J軟件進行光密度分析，獲得數據后統計分析。

2結果

各組大鼠不同時間PWMT、PWTL比較見表1、2。光學顯微鏡下，大鼠背根神經節內見散在分布的FGF-2陽性細胞，其胞質及核內見有呈棕黃色顆粒的免疫反應產物。觀察可見DNP組較C組陽性細胞數量多，陽性標記強度深；DNP組與SC+DNP組相比無明顯差異；GBP+DNP組與DNP組比較，陽性細胞數量少，陽性標記強度弱。C組、DNP組造模后14天背根神經節FGF-2蛋白相對表達量分別為0.42±0.03、1.34±0.10，兩組比較，P<0.05。C組、DNP組、SC+DNP組和GBP+DNP組造模后21天FGF-2蛋白相對表達量分別為0.45±0.32、1.41±0.63、1.23±0.36、0.78±0.41，C組與其他三組比較，GBP+DNP組與DNP組和SC+DNP組比較，P均<0.05；造模后28天四組FGF-2蛋白相對表達量分別為0.43±0.15、1.41±0.12、1.38±0.16、1.29±0.18，C組與其他三組比較，P均<0.05。

表1　各組大鼠不同時間PWMT比較

注：與C組相比，aP<0.05；與DNP組和SC+DNP組相比，bP<0.05；與同組造模前相比，cP<0.05。

注：與C組相比，aP<0.05；與DNP組和SC+DNP組相比，bP<0.05；與同組造模前相比，cP<0.05。

3討論

由STZ誘導的糖尿病動物模型中，糖尿病導致外周神經損傷，引起初級傳入傷害性感受器過度興奮，包括背根神經節產生自發性脈沖，參與疼痛的形成[9]。背根神經節內的大量衛星細胞被激活，增生肥大，最終形成膠質疤，其標志物膠質原纖維酸性蛋白明顯增多，并釋放TNF-α等致炎因子，而TNF-α能夠通過IL-1、Nav1.3、Nav1.8[10]等信號通路增強背根神經節內感覺神經元的興奮性，并誘導背根神經節內的膠質細胞和神經元合成FGF-2[11]。本實驗結果表明，正常大鼠背根神經節中FGF-2的表達較低，STZ誘導后14天背根神經節內FGF-2表達開始上調，第21天最高，此時大鼠的痛覺過敏、痛覺異常表現最為顯著，提示FGF-2的生成與痛覺過敏呈現相同的趨勢，提示FGF-2參與了神經病理痛的產生與維持。

FGF-2在周圍和中樞神經系統內均有分布。在神經病理痛發生時，脊髓內的星形膠質細胞和神經節內衛星細胞FGF-2的表達含量增加，FGF-2是具有神經營養性的多效性細胞因子，能夠激活星形膠質細胞，并影響神經元的興奮性，共同參與疼痛的形成過程。脊神經結扎模型中FGF-2表達的上調參與了機械痛覺過敏，而Madiai等[12]研究亦證實，在坐骨神經結扎大鼠神經痛模型中，通過鞘內注射抗FGF-2抗體，可以減輕大鼠的機械痛敏。本研究中GBP+DNP組大鼠腹腔注射GBP 7 d后，PWMT和PWTL均得到有效改善，且FGF-2的表達也同步下降，說明GBP可通過抑制FGF-2的表達起到鎮痛效果。

綜上可見，DNP大鼠FGF-2表達升高，GBP通過抑制FGF-2的表達可以減輕DNP。但GBP如何調節FGF-2的表達，以及FGF-2通路的作用底物尚不明確，有待進一步的研究。

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收稿日期：(2015-07-24)

通信作者：秦蘇萍

基金項目：徐州醫學院院級科研課題(2014KJ)。

中圖分類號：R322.8；R364.5；R441.1

文獻標志碼：A

文章編號：1002-266X(2015)47-0025-03

doi：10.3969/j.issn.1002-266X.2015.47.009