核磁共振內標法測定乙基麥芽酚對照品的含量

王召平，朱姮，王曉，耿巖玲，仙云霞，于金倩*

(1.山東中醫藥大學，山東 濟南 250355；2.山東省科學院中藥過程控制研究中心，山東省分析測試中心，山東 濟南 250014)

?

核磁共振內標法測定乙基麥芽酚對照品的含量

王召平1，朱姮1，王曉2，耿巖玲2，仙云霞1，于金倩2*

(1.山東中醫藥大學，山東 濟南 250355；2.山東省科學院中藥過程控制研究中心，山東省分析測試中心，山東 濟南 250014)

摘要：建立了用核磁共振內標法準確、快速測定乙基麥芽酚對照品含量的方法。采用Varian Inova 600 MHz超導核磁共振波譜儀，以氘代DMSO-d6為溶劑、苯甲酸為內標，在25 ℃條件下采集乙基麥芽酚和苯甲酸混合物的核磁共振氫譜。以乙基麥芽酚中化學位移在δH6.34和苯甲酸中化學位移在δH7.95的質子信號峰為定量峰，其峰面積y(As/Ar)與其質量比x(ms/mr)的線性回歸方程為y = 0.805 8x+0.087 3，相關系數R=0.999 0。測得3批乙基麥芽酚的質量分數分別為99.47%，99.34%和99.51%。在沒有對照品的情況下，核磁共振內標法可用于乙基麥芽酚對照品的含量測定和質量控制,同時可作為一種在沒有對照品的情況下化合物含量測定的有效方法，為測定其他化學對照品的含量提供一定的參考。

關鍵詞：核磁共振；乙基麥芽酚；含量

Content determination of 2-Ethyl-3-hydroxy-4-pyrone

乙基麥芽酚(2-Ethyl-3-hydroxy-4-pyrone)是一種安全無毒、用途廣、效果好且用量少的理想食品添加劑，增香效果是甲基麥芽酚的6倍，24份香豆素相當于1份乙基麥芽酚[1]。1970年,世界衛生組織及聯合國糧農組織已經確認乙基麥芽酚為食品添加劑[2]。我國《食品添加劑使用衛生標準》GB12487-2010[3]也確認其可作為食品合成香料使用。乙基麥芽酚現已廣泛應用于化妝品、食品、飲料、牙膏、香煙和藥品，是一種安全性高、無毒、增香、增甜、保香和掩蓋異味的常用食品添加劑?，F代研究發現，乙基麥芽酚可以控制人體鐵和鋁的含量水平[4]，在抑制人體過氧化物、抗衰老方面也有一定效果[5]。目前乙基麥芽酚測量方法有高效液相色譜法、反相高效液相色譜法、電化學法、熒光法和氣相色譜法等[6-11]。這些分析測試方法有的操作繁瑣，有的靈敏度不高，存在準確性、可比性和溯源性不是很好的缺陷，并且各種測量方法均需要與標準品對照。

目前，定量核磁共振技術(QNMR)廣泛應用于化學、生物、食品、農業及軍事等領域[12]，在醫藥領域用于對化學藥品、體液樣品、中藥與植物提取物等的定量分析[13-16]。QNMR技術在化合物純度定值、含量測定方面具有準確度高、靈敏度高、分析速度快以及樣品用量少的特點，適合于樣品的含量測定。核磁共振定量分析法先后被美國藥典、英國藥典以及歐洲藥典作為某些藥品的標準測量方法收錄[17-19]，中國藥典也在2010版收錄了該方法[20]。但目前沒有運用QNMR技術對乙基麥芽酚含量測定的相關報道。本研究采用核磁共振內標法測定了乙基麥芽酚對照品的含量，建立了在無需使用對照品的情況下對乙基麥芽酚進行質量控制和含量測定的方法。

1材料與方法

1.1實驗儀器

Inova 600 MHz核磁共振波譜儀(美國Varian公司)。

1.2試劑與樣品

氘代二甲亞砜(99.9%氘代，美國CIL公司)，苯甲酸(質量分數99.2%，批號101253928，美國Sigma 公司)，乙基麥芽酚對照品。乙基麥芽酚和苯甲酸的結構見圖1。

圖1　乙基麥芽酚和苯甲酸的化學結構Fig.1　Chemical structures of 2-Ethyl-3-hydroxy-4-pyrone and benzoic acid

1.3核磁共振采集條件

測定溫度：25 ℃，環境濕度：35%，譜寬：15 000.9 Hz，FT size：131 072，累加次數：64，采集時間：6 s，觀察頻率：600 MHz。

1.4方法

乙基麥芽酚對照品和苯甲酸對照品精密稱取適量，分別放置在核磁共振樣品管中(d=5 mm)，加入氘代試劑適量(二甲亞砜)，振搖使樣品完全溶解，即得樣品溶液。在1.3的核磁共振采集條件下，調整參數，然后進行勻場、核磁數據采集，測得樣品核磁共振氫譜。分別對乙基麥芽酚和苯甲酸的定量峰進行積分，運用以下公式對樣品質量分數進行計算

其中，As：乙基麥芽酚峰面積積分值，Ar：苯甲酸峰面積積分值，ns：乙基麥芽酚定量峰包含的質子數，nr：苯甲酸定量峰包含的質子數，ms：乙基麥芽酚的質量，mr：苯甲酸的質量，Wr：苯甲酸的質量分數，Ms：乙基麥芽酚分子質量，Mr：苯甲酸的分子質量。

2結果與討論

2.1內標物、氘代試劑和特征性定量峰的選擇

核磁共振內標法在內標物選擇上要保證不干擾被測物質的信號峰，本研究選擇苯甲酸為核磁定量內標物。苯甲酸的核磁共振氫譜顯示，其2位和6位質子信號為δH7.95，可以與其他氫信號完全分開[21]。測試溶劑的選擇也至關重要，既要保證被測物質與內標物在溶劑中溶解性好，又要確定氘代溶劑對測定結果不能造成干擾。本次研究選用氘代二甲亞砜為測試溶劑，氘代二甲亞砜對乙基麥芽酚和苯甲酸溶解性都非常好，并且氘代二甲亞砜在核磁共振氫譜上溶劑峰為δH2.49，對乙基麥芽酚與苯甲酸的信號峰沒有干擾，不會影響含量測定結果。

在核磁共振內標法定量分析之前，已通過核磁共振一維譜和二維譜對乙基麥芽酚的信號峰進行了逐一歸屬；在乙基麥芽酚的核磁共振氫譜上可以看到5位的質子信號化學位移為δH6.34[21]，與其他核磁氫信號完全分開，可作為乙基麥芽酚定量分析的特征峰。核磁共振內標法測定乙基麥芽酚含量的氫譜如圖2所示。

圖2　核磁共振內標法測定乙基麥芽酚含量的氫譜Fig.2　1H-NMR spectrum of QNMR determined 2-Ethyl-3-hydroxy-4-pyrone

2.2線性關系

按照1.4實驗方法，配置6種不同濃度的待測樣品溶液，依照1.3的核磁共振采集條件，測定每種濃度樣品的核磁共振氫譜，并分別對乙基麥芽酚和苯甲酸特征信號峰的峰面積進行積分，每個樣品積分3次，取3次積分的平均值作為乙基麥芽酚的積分面積，具體結果如表1所示。

表1　乙基麥芽酚和苯甲酸的質量及氫譜峰面積積分值

注：ms為乙基麥芽酚質量，mr為苯甲酸的質量，As為乙基麥芽酚峰面積積分值，Ar為苯甲酸峰面積積分值。

將x作為乙基麥芽酚與苯甲酸質量的比值，y作為乙基麥芽酚與苯甲酸的積分面積的比值，進行線性關系計算，求得線性回歸方程：y= 0.805 8x+0.087 3(R= 0.999 0，n=6)。計算結果表明，所建立的以苯甲酸為內標物測定乙基麥芽酚含量的方法，線性關系良好。

2.3穩定性實驗

抽取表1中的5號樣品，放置在室溫下，按照上述1.4的實驗方法，分別在0、4、8、12、16 h后測定，對乙基麥芽酚進行穩定性測試，計算得出RSD為0.66%。實驗說明該樣品溶液在16 h內穩定性良好。

2.4重復性實驗

抽取表1中的5號樣品，在相同的實驗條件下按照1.4的實驗方法重復測定6次，以乙基麥芽酚與苯甲酸定量特征峰的積分面積比值進行計算，得出RSD為0.32%。結果說明該方法具有良好的重現性。

2.5采樣次數的選擇

增加樣品的采樣次數，可以提高信號性噪比，樣品峰的積分數據更加穩定。本次實驗分別設置采樣次數為4、8、16、32、64、128，對樣品分別進行掃描測試。通過實驗得出，采樣次數的增大對乙基麥芽酚和苯甲酸積分面積的比值基本沒有影響，而且增加了樣品分析時間，64次采樣次數足以滿足本實驗對精密度的要求，故設置采樣次數為64。

2.6加樣回收率實驗

分別精密稱取乙基麥芽酚樣品4、5、6 mg各2份，精密稱取乙基麥芽酚標準品6、5、4 mg各2份，并將標準品分別加入到乙基麥芽酚樣品中，依照1.4的實驗方法依次測定待測樣品的核磁共振氫譜，依據回收率公式：回收率(%)= [測得含量-樣品含量]/標準品添加量[22]，計算得出乙基麥芽酚的樣品回收率，實驗結果如表2所示。

表2　加樣回收率測試結果(n=6)

2.7樣品測定

取3個批次的乙基麥芽酚對照品，采用HPLC法測定其相對質量分數，同時依照上述1.3實驗條件和1.4實驗方法，測定上述3個批次乙基麥芽酚對照品與苯甲酸特征峰的峰面積，按照1.4的計算公式計算，可得乙基麥芽酚對照品的絕對質量分數，測定結果如表3所示。通過表3數據對比可得出，運用高效液相歸一化法得到的乙基麥芽酚的質量分數略高于核磁共振內標法，主要是由于核磁共振內核法測定時去除了乙基麥芽酚的吸收水分，只測定了絕對含量[22]。

表3　測定乙基麥芽酚對照品含量的實驗結果(質量分數/%)

3結論

上述實驗采用磁共振內核方法，以氘代DMSO為溶劑，苯甲酸為內標物，建立測定乙基麥芽酚對照品含量的方法。實驗結果表明，采用磁共振內核方法對乙基麥芽酚含量進行測定，線性關系、重復性和穩定性均良好。此方法具有原子核吸收共振面積只與原子數目有關、不受外界環境影響、測量時無需使用標準品對照、無需引入校正因子、樣品使用量少、適用范圍廣、操作簡單、分析速度快，含量測定和結構鑒定可同步完成的特點，與傳統的測量方法相比，具有較大的優勢。因此，磁共振內核法可以作為對照品含量測定的一種新方法，廣泛運用于其他化學對照品含量的測定。

參考文獻：

[1]穆旻, 鄭福平, 孫寶國, 等. 麥芽酚和乙基麥芽酚的合成及其在食品工業中的應用[J]. 中國食品學報, 2006, 6(1): 407-410.

[2] 劉志皋, 高彥祥. 食品添加劑基礎[M]. 北京:中國輕工業出版社, 1999： 3-9.

[3] 食品安全國家標準 食品添加劑 乙基麥芽酚, GB 12487-2010[S].

[4] 周艷梅, 王亞萍, 周華, 等. 流動注射化學發光法測定飲料中乙基麥芽酚[J]. 食品研究與開發, 2011, 32(9): 159-161.

[5] 程幫琴, 孫建, 胡惟孝. 結晶母液中乙基麥芽酚回收工藝的研究[J]. 浙江化工, 2014, 45(5): 30-34.

[6] 王浩, 劉艷琴, 楊紅梅, 等. 高效液相色譜法測定飲料中乙基麥芽酚的研究[J]. 食品科技, 2006(8): 235-236.

[7] 趙志紅, 張逢秋, 朱慧. 反相高效液相色譜法同時測定食品中香蘭素、乙基麥芽酚的含量[J]. 食品科技, 2006(12): 136-137.

[9] 彭少華, 馬文華, 狄俊偉. 分光光度法、高效液相色譜法和伏安法測定麥芽酚和乙基麥芽酚[J]. 光譜實驗室, 2005, 04: 680-682.

[10] 李暢, 董學芝, 宋玉芳, 等. 熒光素法測定乙基麥芽酚的含量[J]. 食品研究與開發, 2008, 29(6): 101-103.

[11] 陳柯星, 柯華, 林捷. 食品中乙基麥芽酚的氣相色譜分析方法研究[J]. 中國衛生檢驗雜志, 2011, 21(11): 2629-2630.

[12] 陳俊杰, 李裕林. 黃酮類化合物的1H NMR研究[J]. 波譜學雜志, 1994, 11(3): 301-306.

[13] 高照明, 張玉冰, 于永良. 核磁共振內標法定量分析肝素鈉中多硫酸軟骨素[J]. 分析化學, 2011, 39(4): 601-602.

[14] 郭強勝, 石高旗, 宋巍, 等. NMR定量測定片劑中的對乙酰氨基酚[J]. 分析測試學報, 2012, 31(1): 117-120.

[15] 易進海, 劉云華, 陳燕, 等. 核磁共振波譜法測定藁本內酯對照品的含量[J]. 藥物分析雜志, 2010, 30(4): 680-682.

[16] 楊亮, 茹閣英, 唐惠儒, 等. 核磁共振電信號內標法在人體尿液定量分析中的應用[J]. 分析化學, 2010,38(6): 789-794.

[17] 于小波, 相秉仁, 王國華, 等. 核磁共振法測定硫酸依替米星含量[J]. 中國抗生素雜志, 2011, 36(8): 610-612.

[18] United States Pharmacopoeia Commission. United States Pharmacopoeia [M]. US: US Pharmacopoeia Convention, Inc. , 2000: 1221-1222.

[19] 李建發, 孫永躍, 藍丹, 等.1H NMR定量分析葛根素含量研究[J]. 實驗技術與管理, 2011, 28 (12): 36-39.

[20]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典2010年版一部[M]. 北京: 中國醫藥科技出版社, 2010: 1208.

[21] 耿巖玲, 馬然, 劉偉, 等. 核磁共振內標法測定蘇丹紅Ⅰ對照品的含量[J]. 山東科學, 2013, 26(5): 10-13.

[22] 仙云霞, 耿巖玲, 周洪雷, 等. 核磁共振內標法測定覆盆子酮對照品的含量[J]. 山東科學, 2015, 28(1): 7-11.

【中藥與天然活性產物】

reference with1H-NMR spectroscopy

WANG Zhao-ping1,ZHU Heng1,WANG Xiao2,GENG Yan-ling2,

XIAN Yun-xia1,YU Jin-qian2*

(1.Shangdong University of Traditional Chinese Medicine, Jinan 250355,China;2.Process Control Research

Center of Traditional Chinese Medicine, Shandong Analysis and Test Center, Jinan 250014, China)

Abstract∶We established a rapid and accurate method to determine the content of 2-Ethyl-3-hydroxy-4-pyrone reference by quantitative nuclear magnetic resonance.We acquired1H-NMR spectra of 2-Ethyl-3-hydroxy-4-pyrone and benzoic acid mixture at 25 ℃ with Varian Inova 600 MHz spectrometer, DMSO-d6as solution, and benzoic acid as internal standard.We determined the contents of 3 batches of 2-Ethyl-3-hydroxy-4-pyrone were 99.47%, 99.34% and 99.51% with proton signals at δH6.34 of 2-Ethyl-3-hydroxy-4-pyrone and δH7.95 of benzoic acid as quantification peaks, whose linear regression equation of peak areas ratio y(As/Ar) and mass ratio x(ms/mr) was y = 0.8058x+0.0873 and correlation coefficient was 0.999 0.The method can be applied to content determination and quality control of 2-Ethyl-3-hydroxy-4-pyrone reference without any references.It can also provide references for content determination of other substances.

Key words∶QNMR; 2-Ethyl-3-hydroxy-4-pyrone;content

DOI:10.3976/j.issn.1002-4026.2015.04.007

中圖分類號：R284.1

文獻標識碼：A

文章編號：1002-4026(2015)04-0030-05

通訊作者*,于金倩(1987-)，女，助理研究員，博士，研究方向為天然產物提取分離及標準樣品制備。Email:yujinqian87528@126.com

作者簡介：王召平(1988-)，男，碩士研究生，研究方向為天然產物分離與純化。

基金項目：山東省分析測試中心所 (CS201305)

收稿日期：2015-05-15