消腫方對(duì)骨關(guān)節(jié)炎兔軟骨下骨成骨細(xì)胞OPG及RANKL mRNA表達(dá)的影響

李　亮，劉安平，周正新，周章武，徐盛文，李文華

(安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院骨傷科，安徽 合肥　230031)

?

消腫方對(duì)骨關(guān)節(jié)炎兔軟骨下骨成骨細(xì)胞OPG及RANKL mRNA表達(dá)的影響

李亮，劉安平，周正新，周章武，徐盛文，李文華

(安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院骨傷科，安徽 合肥230031)

[摘要]目的觀察消腫方對(duì)骨關(guān)節(jié)炎兔軟骨下骨成骨細(xì)胞骨保護(hù)素(osteoprotegerin，OPG)及核因子-κB受體活化因子配體(receptor activator of nuclear factor-kappa B ligand，RANKL)mRNA表達(dá)的影響。方法將30只新西蘭大耳白兔隨機(jī)分為空白對(duì)照組，模型組，消腫方低、中、高劑量組，每組6只。采用改良Hulth法復(fù)制膝關(guān)節(jié)骨關(guān)節(jié)炎模型，消腫方低、中、高劑量組分別給予40、80、160 g/kg消腫方煎劑灌胃，空白對(duì)照組和模型組分別以等容積生理鹽水灌胃，共28 d。光鏡下觀察兔膝關(guān)節(jié)關(guān)節(jié)軟骨下骨成骨細(xì)胞形態(tài)，采用RT-PCR法檢測(cè)OPG、RANKL mRNA的表達(dá)。結(jié)果空白對(duì)照組與模型組OPG mRNA表達(dá)水平比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；消腫方高、中、低劑量組OPG mRNA表達(dá)水平均較模型組顯著升高(P<0.05)，具有明顯的劑量依賴性。模型組RANKL mRNA表達(dá)水平低于空白對(duì)照組，消腫方低、中、高劑量組RANKL mRNA表達(dá)水平較模型組逐漸降低，但差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；消腫方高劑量組RANKL mRNA表達(dá)水平顯著低于低劑量組(P<0.05)。結(jié)論消腫方可上調(diào)骨關(guān)節(jié)炎動(dòng)物模型軟骨下骨成骨細(xì)胞OPG mRNA表達(dá)，下調(diào)RANKL mRNA表達(dá)。

[關(guān)鍵詞]消腫方；骨關(guān)節(jié)炎；補(bǔ)腎活血利水法；成骨細(xì)胞；骨保護(hù)素；RANKL

消腫方是安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院骨傷科國(guó)家級(jí)名老中醫(yī)丁鍔教授的經(jīng)驗(yàn)方，以補(bǔ)腎活血利水為主，對(duì)骨關(guān)節(jié)炎具有較好的療效[1]。前期研究顯示，補(bǔ)腎活血利水法可促進(jìn)軟骨細(xì)胞增殖，抑制骨細(xì)胞凋亡，調(diào)控滑膜組織基因表達(dá)譜，其作用機(jī)制與多種細(xì)胞信號(hào)通路有關(guān)[2]。其中骨保護(hù)素/核因子-κB受體活化因子配體(osteoprotegerin/receptor activator of nuclear factor-kappa-B ligand，OPG/RANKL)通路對(duì)骨關(guān)節(jié)炎軟骨下骨重建的調(diào)控作用已成為研究熱點(diǎn)之一[3]。本研究通過(guò)復(fù)制兔骨關(guān)節(jié)炎動(dòng)物模型，觀察不同濃度消腫方對(duì)骨關(guān)節(jié)炎動(dòng)物的軟骨下骨成骨細(xì)胞OPG及RANKL mRNA表達(dá)的影響，以探究消腫方治療骨關(guān)節(jié)炎的機(jī)制。

1材料

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物7月齡新西蘭大耳白兔30只，體質(zhì)量2.6～3.2 kg，雌雄各半，購(gòu)自安徽中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，普通級(jí)。

1.2實(shí)驗(yàn)藥物與試劑OPG、RANKL多克隆抗體：武漢博士德試劑公司；實(shí)時(shí)定量PCR擴(kuò)增儀：美國(guó)Roche公司；TRIzol試劑：美國(guó)Life Technologies公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒：美國(guó)Qiagen公司；DNA marker：北京天為時(shí)代公司；引物：上海滬晶生物芯片公司。

消腫方(茯苓皮20 g，懷牛膝、黃芪各15 g，當(dāng)歸、萆薢各10 g，莪術(shù)8 g，等)生藥飲片由安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院中藥房提供，制備成不同濃度的水煎劑。

1.3儀器石蠟切片機(jī)：Leica2135；BM-Ⅱ型病理組織包埋機(jī)：安徽省電子科學(xué)研究所；ZT-RP生物組織脫水機(jī)、QP切片漂烘溫控儀：湖北省孝感市亞光醫(yī)用電子技術(shù)有限公司；Nikon80熒光顯微鏡：新飛達(dá)光學(xué)儀器公司。

2方法

2.1動(dòng)物模型復(fù)制及分組將30只新西蘭大耳白兔隨機(jī)分為5組：空白對(duì)照組，模型組，消腫方低劑量(40 g/kg，相當(dāng)于臨床劑量3倍)、中劑量(80 g/kg)、高劑量(160 g/kg)組，每組6只。除空白對(duì)照組外，其余各組動(dòng)物采用改良Hulth法[4]復(fù)制膝骨關(guān)節(jié)炎模型。3%戊巴比妥鈉按30 mg/kg靜脈注射麻醉，麻醉生效后，常規(guī)無(wú)菌操作、鋪巾，取兔膝關(guān)節(jié)前內(nèi)側(cè)髕旁入路，切開(kāi)皮膚及皮下組織、內(nèi)側(cè)支持帶及關(guān)節(jié)囊后，將髕骨向外側(cè)脫位，顯露膝關(guān)節(jié)腔，顯露內(nèi)側(cè)半月板及前交叉韌帶，依次切除內(nèi)側(cè)半月板，切斷內(nèi)側(cè)副韌帶，切斷前交叉韌帶，再逐層關(guān)閉關(guān)節(jié)囊、皮下組織、皮膚，敷料包扎切口，不予外固定，復(fù)制模型后連續(xù)4 d用青霉素3萬(wàn)U肌肉注射，10 d后開(kāi)始每天強(qiáng)迫兔活動(dòng)40 min，連續(xù)6周。對(duì)消腫方低、中、高劑量組兔分別灌胃給予40、80、160 g/kg消腫方煎劑，對(duì)空白對(duì)照組和模型組兔灌胃給予生理鹽水，連續(xù)28 d。

2.2膝關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察在相對(duì)無(wú)菌條件下于膝關(guān)節(jié)負(fù)重區(qū)用骨刀垂直于股骨髁關(guān)節(jié)面切取骨軟骨組織塊，并去除關(guān)節(jié)軟骨周?chē)能浗M織及骨組織，磷酸鹽緩沖液漂洗，用無(wú)水乙醇固定，脫鈣處理，石蠟包埋，切片，蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin, HE)染色，光鏡下觀察關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞。

2.3軟骨下骨成骨細(xì)胞總RNA提取及測(cè)定采用TRIzol一步法，按產(chǎn)品操作說(shuō)明提取軟骨下骨成骨細(xì)胞總RNA。采用紫外分光光度計(jì)測(cè)定總RNA的光密度(optical density，OD)，計(jì)算OD260/OD280比值，測(cè)定其濃度和純度。RNA完整性的檢測(cè)采用普通瓊脂糖凝膠電泳法，提取的總RNA于-70 ℃保存。

2.4兔軟骨下骨成骨細(xì)胞OPG、RANKL mRNA表達(dá)采用RT-PCR法，以β-actin基因?yàn)閮?nèi)參。OPG反應(yīng)條件[5]：95 ℃高溫變性1 min，54 ℃降溫退火40 s，71 ℃升溫延伸1 min，共30個(gè)循環(huán)，最后71 ℃升溫延伸7 min。RANKL反應(yīng)條件：95 ℃高溫變性1 min，54 ℃降溫退火40 s，71 ℃升溫延伸1 min，共30個(gè)循環(huán)，最后71 ℃升溫延伸7 min。引物序列：OPG上游引物：5′-TGTGGCCATGCGTTCTAGTCACCT-3′，下游引物：5′-TAGGGACCCAAGCCTTGCATCGGA-3′，擴(kuò)增長(zhǎng)度為478 bp；RANKL上游引物：5′-TTCCTCGAACTCAGTGCGAGAG-3′，下游引物：5′-CCGACCTGAGGTAATTCGCGTC-3′，擴(kuò)增長(zhǎng)度為449 bp；β-actin上游引物：5′-GAAGGCAGACGTTCAACACGGC-3′，下游引物：5′-GTGGCCATCTCACTTGCTGCAACAG-3′，擴(kuò)增長(zhǎng)度為310 bp。以15 g/L瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳并拍照，對(duì)條帶的OD值進(jìn)行檢測(cè)，計(jì)算條帶OD值與β-actin OD值的比值。

3結(jié)果

3.1兔膝關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化空白對(duì)照組兔關(guān)節(jié)軟骨厚度正常，關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞形態(tài)正常，排列均勻(見(jiàn)圖1A)；模型組兔關(guān)節(jié)軟骨厚度變薄，關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則，排列較散亂(見(jiàn)圖1B)；各治療組可見(jiàn)關(guān)節(jié)軟骨厚度明顯改善，關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則，排列散亂，隨治療藥物劑量增加，軟骨細(xì)胞數(shù)量增加(見(jiàn)圖1C—1E)。

圖1各組兔膝關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞形態(tài)(HE染色，10×40倍)

3.2兔軟骨下骨成骨細(xì)胞總RNA質(zhì)量鑒定提取軟骨下骨成骨細(xì)胞的總RNA，經(jīng)分光光度計(jì)分別在260 nm和280 nm波長(zhǎng)測(cè)定OD值，計(jì)算OD260/OD280比值，所有樣品總RNA的OD260/OD280比值均在1.80～2.10之間。經(jīng)普通瓊脂糖凝膠電泳分析，結(jié)果提示RNA未被降解。

3.3各組兔軟骨下骨成骨細(xì)胞OPG、RANKL mRNA表達(dá)比較空白對(duì)照組與模型組OPG、RANKL mRNA表達(dá)水平比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；消腫方高、中、低劑量組OPG mRNA表達(dá)水平均較模型組顯著升高(P<0.05)，RANKL mRNA表達(dá)水平均較空白對(duì)照組顯著降低(P<0.05)；隨著消腫方劑量升高，OPG mRNA表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)，RANKL mRNA表達(dá)水平逐漸降低，其中消腫方高劑量組RANKL mRNA表達(dá)水平顯著低于低劑量組(P<0.05)。見(jiàn)圖2、表1。

注：1. Marker；2. 空白對(duì)照組；3. 模型組；4. 消腫方低劑量組；5. 消腫方中劑量組；6. 消腫方高劑量組。

表1　各組兔軟骨下骨成骨細(xì)胞OPG、RANKL mRNA相對(duì)表達(dá)水平比較

注：同列含有相同右上標(biāo)符號(hào)的組別相比較，P>0.05；同列不含相同右上標(biāo)符號(hào)的組別相比較，P<0.05。

4討論

有研究[6]表明，OPG/RANKL系統(tǒng)是破骨細(xì)胞與成骨細(xì)胞之間發(fā)生互相作用的信號(hào)通道，OPG最初于1997年被兩個(gè)獨(dú)立的實(shí)驗(yàn)室同時(shí)發(fā)現(xiàn)。RANKL分子由317個(gè)氨基酸組成，有一個(gè)細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域(其中包含一個(gè)配基結(jié)合位點(diǎn))、一個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域和一個(gè)N端胞漿結(jié)構(gòu)域組成，可由T、B淋巴細(xì)胞、骨髓干細(xì)胞、成骨細(xì)胞前體細(xì)胞以及成熟的成骨細(xì)胞等分泌。

最近研究[7]發(fā)現(xiàn)，成骨細(xì)胞能產(chǎn)生巨噬細(xì)胞集落刺激因子(macrophage colony-stimulating factor,MCSF)和RANKL，能夠與位于破骨細(xì)胞前體上的受體相結(jié)合，從而能刺激破骨細(xì)胞的增殖和分化，并能增加破骨細(xì)胞活力；而成骨細(xì)胞則能產(chǎn)生一種名為OPG的蛋白，與RANKL相結(jié)合，從而阻止RANKL與破骨細(xì)胞的相互作用。RANKL和OPG的平衡對(duì)于骨破壞速度起著關(guān)鍵性的作用。在雌激素缺乏的人群中，其體內(nèi)RANKL水平增加[8]，當(dāng)RANKL水平過(guò)高或者OPG水平不足，將會(huì)引起骨丟失，但血液中RANKL和OPG的含量測(cè)量結(jié)果卻不支持該理論。在骨折及低骨量患者中，OPG水平升高，RANKL水平降低[9-10]。有關(guān)大鼠骨關(guān)節(jié)炎動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，關(guān)節(jié)軟骨退變程度增加時(shí)，RANKL及runt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子(runt-related transcripttion factor，RUNX)、MCSF、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子等多種物質(zhì)顯著增加，而OPG的表達(dá)卻降低[11]。

骨關(guān)節(jié)炎相當(dāng)于中醫(yī)學(xué)“痹證”，其為本虛標(biāo)實(shí)之病。腎主骨、主水，腎虛則骨關(guān)節(jié)失養(yǎng)、水無(wú)所主，可致局部腫脹；外傷或勞損可致局部氣血運(yùn)行不暢，形成瘀血，則出現(xiàn)疼痛。故本病以肝腎虧虛為本，氣滯血瘀、筋脈痹阻為標(biāo)，通過(guò)中藥內(nèi)服外用以補(bǔ)肝腎、強(qiáng)筋骨、疏經(jīng)絡(luò)，達(dá)到標(biāo)本兼治的目的[12]。消腫方重用牛膝以補(bǔ)肝腎、強(qiáng)筋骨、利水祛濕、活血化瘀、引血下行，用于痹痛日久、腰膝酸痛等癥，為君藥；茯苓健脾利水、滲濕消腫，黃芪健脾補(bǔ)中益氣，為治療氣虛水腫之要藥，兩者合為臣藥；莪術(shù)行氣破血、消積止痛，偏于行氣通絡(luò)止痛，用于痰濕阻滯所致的肢體關(guān)節(jié)疼痛；萆薢利水滲濕、祛風(fēng)除痹、通絡(luò)止痛，善治腰膝痹痛、筋脈屈伸不利，兩藥同為佐使藥。全方配伍，共奏補(bǔ)腎利水、活血化瘀之功，對(duì)痰、瘀、水互阻所致的骨關(guān)節(jié)炎能起較好的治療作用。本研究結(jié)果表明，消腫方中藥煎劑可顯著提高骨關(guān)節(jié)炎兔軟骨下骨成骨細(xì)胞OPG mRNA的表達(dá)水平，同時(shí)可降低成骨細(xì)胞RANKL mRNA的表達(dá)水平。由此可見(jiàn)，消腫方可能通過(guò)上調(diào)OPG mRNA的表達(dá)和下調(diào)RANKL mRNA的表達(dá)，抑制破骨細(xì)胞的活化，從而抑制破骨細(xì)胞的骨吸收功能。

參考文獻(xiàn)：

[1]李亮，劉安平，周正新，等.消腫方治療膝關(guān)節(jié)骨關(guān)節(jié)炎療效觀察[J].安徽中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2012，31(3)：24-25.

[2]李亮，劉安平，周正新，等.補(bǔ)腎活血法治療膝關(guān)節(jié)骨關(guān)節(jié)炎的作用機(jī)制研究[J].河南中醫(yī)，2014，34(3)：50-52.

[3]陳賽楠，廖乃順，陳文列，等.OPG/RANKL/RANK系統(tǒng)在調(diào)控骨性關(guān)節(jié)炎軟骨下骨骨重建中的作用[J].骨科，2013，4(4):214-216.

[4]Rogart JN，Barrach HJ，Chichester CO. Articular collagen degradation in the Hulth-Telhag model of osteoarthritis[J].Osteoarthritis and Cartilage，1999，7(6):539-547.

[5]郭幫富，羅江，邵敏，等.骨康對(duì)體外培養(yǎng)人成骨細(xì)胞OPG及RANKL基因表達(dá)的影響[J].廣州中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2012，29(4)：392-396.

[6]Omisky MS，Li X，Asuncion FJ，et al. RANKL inhibition with osteoprotegerin increases bone strength by improving cortical and trabecular bone architecture in ovariectomized rats[J].J Bone Miner Res，2008，23(5)：672-682.

[7]Khosla S. Minireview: the OPG/RANKL/RANK system[J]. Endocrinology，2001，142(12)：5050-5055.

[8]Eghbali-Fatourechi G，Khosla S，Sanyal A，et al. Role of RANK ligand in mediating increased bone resorption in early postmenopausal women[J].J Clin Invest，2003，111(8): 1221-1230.

[9]Schett G，Kiechl S，Redlich K，et al. Soluble RANKL and risk of nontraumatic fracture[J].JAMA，2004，291(9)：1108-1013.

[10]Jorgensen HL， Kusk P， Madsen B，et al. Serum osteoprotegerin (OPG) and the A163G polymorphism in the OPG promoter region are related to peripheral measures of bone mass and fracture odds ratios[J].J Bone Miner Metab，2004，22(2):132-138.

[11]Jiao K，Nin LN，Wang MQ，et al. Subchondral bone loss following orthodontically induced cartilage degradation in the mandibular condyles of rats[J].Bone，2011，48(2)：362-371.

[12]李亮，劉安平、周正新，等.膝關(guān)節(jié)骨關(guān)節(jié)炎的中醫(yī)藥治療研究進(jìn)展[J].中醫(yī)學(xué)報(bào)，2014，29(6)：113-116.

Effects of Detumescence Prescription on mRNA Expression of Osteoprotegerin and Receptor Activator of Nuclear Factor-Kappa B Ligand in Subchondral Bone Osteoblasts in Rabbits with Osteoarthritis

LILiang,LIUAn-ping,ZHOUZheng-xin,ZHOUZhang-wu,XUSheng-wen,LIWen-hua

(DepartmentofOrthopaedics,TheFirstAffiliatedHospitalofAnhuiUniversityofChineseMedicine,AnhuiHefei230031,China)

[Abstract]ObjectiveTo investigate the effects of detumescence prescription on the mRNA expression of osteoprotegerin (OPG) and receptor activator of nuclear factor-kappa B ligand (RANKL) in subchondral bone osteoblasts in the rabbit model of osteoarthritis. MethodsThirty New Zealand big-eared white rabbits were randomly and equally divided into blank control group, model group, and low-, middle-, and high-dose detumescence prescription groups. A model of knee osteoarthritis was established with the modified Hulth method. The low-, middle, and high-dose detumescence prescription groups received decoction of detumescence prescription (40, 80, and 160 g/kg, respectively) by gavage, while the blank control group and model group received an equal volume of normal saline by gavage. The course of treatment was 28 d for each group. The morphology of subchondral bone osteoblasts of the knee joint was observed under a light microscope. The mRNA expression of OPG and RANKL was measured by RT-PCR.ResultsThere was no significant difference in OPG mRNA expression between the blank control group and the model group (P>0.05); the high-, middle-, and low-dose detumescence prescription groups had significantly increased OPG mRNA expression compared with the model group (P<0.05), showing a significant dose dependence. The model group had lower RANKL mRNA expression than the blank control group, and the low-, middle-, and high-dose detumescence prescription groups had gradually reduced RANKL mRNA expression compared with the model group (P>0.05); the RANKL mRNA expression was significantly lower in the high-dose detumescence prescription group than in the low-dose detumescence prescription group (P<0.05). ConclusionDetumescence prescription can up-regulate the OPG mRNA expression and down-regulate the RANKL mRNA expression in subchondral bone osteoblasts in the rabbit model of osteoarthritis.

[Key words]detumescence prescription; osteoarthritis; kidney-tonifying, blood-activating, and diuresis-promoting therapy; osteoblast; osteoprotegerin; receptor activator of nuclear factor-kappa B ligand

收稿日期：(2014-09-24；編輯：曹健)

[中圖分類(lèi)號(hào)]R684.3[DOI]10.3969/j.issn.2095-7246.2015.02.019

作者簡(jiǎn)介：李亮(1979-)，男，碩士，主治醫(yī)師